Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom örtlichen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
1. Vorbereitung für den hitzeinduzierten Anfallstest
- Schalten Sie die Taste Einschalten an der Wärmekammer ein, gefolgt von der Taste Einheizen.
- Stellen Sie die Temperatur der Wärmekammer über die Tastatur am digitalen Temperaturregler auf 50 °C ein.
- Warten Sie mindestens 1 Stunde, um die Kammer auf 50 °C vorzuheizen, bevor Sie die erste Maus in die Kammer einführen. Das Vorwärmen sorgt für eine gleichmäßige Erwärmung im Inneren der Kammer.
- Legen Sie den Boden der Mäuse-Wärmekammer mit Lehmbettwäsche aus.
- Montieren Sie eine Videoaufzeichnungskamera vor der Wärmekammer, um jeden hitzeinduzierten Anfallsassay-Versuch aufzuzeichnen.
- Eine Petrischale mit einem Durchmesser von 140 mm mit dicken Schichten Seidenpapier auslegen und als Kühlkissen auf Eis legen.
HINWEIS: Am Ende des Assays werden die einzelnen Mäuse auf das vorgekühlte Kühlkissen übertragen, um ihre erhöhte Körpertemperatur zu senken.
2. Vorbereitung der Maus auf den hitzeinduzierten Anfallstest
- Wählen Sie 10 adulte Mäuse (P30-P40), 5 mit der epilepsieverursachenden Mutation und 5 der Wildtyp-Wurfgeschwister für den hitzeinduzierten Anfallsscreening-Assay aus.
HINWEIS: Wildtyp-Mäuse, die keine Epilepsie verursachende Mutation aufweisen, zeigen bei Temperaturen unter 44 °C keine hitzeinduzierten Anfälle und dienen als Kontrollgruppe.
- Wiegen Sie jede Maus, die für den Screening-Assay verwendet werden soll, und zeichnen Sie ihr Körpergewicht auf. Für den Assay sollten nur Mäuse mit einem Gewicht von 15 g oder mehr verwendet werden.
- Zeigen Sie jeweils eine Maus in der Wärmekammer der Maus an.
- Betäuben Sie die Maus kurz für 10-15 s mit ein paar Tropfen Isofluran auf dem Boden einer Glasglocke.
- Nehmen Sie das Tier aus der Glocke und legen Sie es auf ein Papiertuch.
- Stellen Sie sicher, dass die Maus vollständig betäubt ist, indem Sie überprüfen, ob die Maus nicht auf ein schädliches Zehenklemmen reagiert.
- Beschichten Sie die Metallspitze des rektalen Temperaturfühlers mit einem Gleitmittel (z. B. Vaseline) und führen Sie es vorsichtig in einer Tiefe von weniger als oder gleich 2 cm in die Maus ein.
- Befestigen Sie die rektale Sonde mit Klebeband am Schwanz der Maus, damit die Sonde während des Assays nicht herauskommt.
HINWEIS: Alternativ können Sie das Tier in einen Mäusehaltekegel legen und den rektalen Temperaturfühler einführen. Sichern Sie es, indem Sie es an den Schwanz kleben.
- Stellen Sie sicher, dass die Rektalsonde an ein Multimeter angeschlossen ist, das die innere Körpertemperatur der Maus anzeigt.
- Setzen Sie das Tier in einen frischen Käfig, der mit Lehmeinstreu ausgekleidet ist, d. h. in den Auffangkäfig.
- Starten Sie einen Timer und warten Sie 5 Minuten. Beobachten Sie die Maus, bis sie sich vollständig von der Narkose erholt hat und die Maus aktiv ist und sich putzt.
- Überwachen Sie gleichzeitig die Körperkerntemperatur der Maus, bis sie sich bei 35-36 °C stabilisiert hat.
- Notieren Sie nach 5 Minuten die Körpertemperatur der Maus. Dies ist die anfängliche Körpertemperatur zum Zeitpunkt "0" min.
HINWEIS: Wenn die Körperkerntemperatur der Maus unter 35 °C liegt, warten Sie zusätzliche Zeit, bis sich das Tier von der anästhesieinduzierten Unterkühlung erholt hat.
- Übertragen Sie die einzelne Maus schnell in die vorgeheizte Mauskammer. Dies markiert den START des Versuchs. Es wird jeweils nur eine Maus angezeigt.
3. Hitzeinduzierter Anfallstest
- Nachdem Sie die Maus vorsichtig auf den Boden der vorgeheizten Maus-Wärmekammer gelegt haben, schließen Sie die Plexiglastür und starten Sie die Kamera für die Videoaufzeichnung des Experiments.
- Starten Sie die Stoppuhr. Erfassen Sie die Körpertemperatur der Maus vom Rektalthermometer in Abständen von 1 Minute für die Dauer des Experiments.
- Erhöhen Sie in regelmäßigen Abständen die Temperatur der Wärmekammer der Maus, so dass die Körpertemperatur der Maus mit einer Rate von 0,25-0,5 °C /min ansteigt.
HINWEIS: Ein schneller Anstieg der Körpertemperatur kann zu einem Hitzschlag oder Tod führen und sollte vermieden werden.
- Befolgen Sie dieses Protokoll, erhöhen Sie die Temperatur der Wärmekammer der Maus alle 10 Minuten um 5 °C, wie in Abbildung 1A gezeigt.
- Stellen Sie bei 9,5 min die Temperatur der Wärmekammer auf 55 °C ein, um die Temperatur der Wärmekammer bis zur 10. Minute auf 55 °C zu stabilisieren, wie auf der digitalen Temperaturanzeige angezeigt.
- Erhöhen Sie auf ähnliche Weise die Temperatur bei 19,5 min auf 60 °C, um die Temperatur der Wärmekammer bis zur 20. Minute auf 60 °C zu stabilisieren. Jeder Anfallsscreening-Versuch dauert 30 Minuten.
- Wenn die Maus einen Anfall hat (vokalisiert, Kopfnicken, Klonus der Vordergliedmaßen, Streckung der Hintergliedmaßen, Stürze auf die Seite oder generalisierte tonische/klonische Krämpfe), notieren Sie die folgenden Informationen.
- Erfassen Sie die Körpertemperatur der Maus während des Anfalls (Anfallsschwellentemperatur) vom rektalen Temperaturthermometer.
- Zeichnen Sie die Merkmale des Anfallsverhaltens auf, wie z. B. Kopfnicken, Klonus der Vordergliedmaßen, Streckung der Hintergliedmaßen, Fallen auf die Seite und/oder generalisierte tonische/klonische Anfälle (GTCS), die von der Maus angezeigt werden.
- Nehmen Sie die Maus schnell, aber vorsichtig aus der Kammer und legen Sie sie auf das in Schritt 1.6 vorbereitete Kühlkissen.
HINWEIS: Wenn eine Maus Anfälle mit Racine-Schuppe 5 hat und unkontrolliertes Springen zeigt, kann es schwierig sein, das Tier aus der Wärmekammer zu nehmen und auf das Kühlkissen draußen zu bringen. Ein typischer hitzeinduzierter Anfall dauert jedoch zwischen 30 s und 60 s. Daher sollte die Maus innerhalb von 60 s nach Beginn der hitzeinduzierten Anfallsepisode aus der Wärmekammer genommen und auf das Kühlkissen gelegt werden.
- Warten Sie, bis die Körpertemperatur der Maus auf 36-37 °C gesunken ist, bevor Sie sie in einen Auffangkäfig bringen. Es wird jeweils nur eine Maus in einen Bergungskäfig gelegt.
HINWEIS: Mischen Sie Mäuse, die noch nicht für das hitzeinduzierte Screening verwendet wurden, nicht mit der Maus, die bereits den Versuch des hitzeinduzierten Anfallsexperiments erlebt hat.
- Schneiden Sie vorsichtig und vorsichtig das Klebeband zwischen dem Mausschwanz und dem Kabel der Rektumsonde mit einer Schere ab, um die Rektumsonde von der Maus zu entfernen.
- Wischen Sie die Metallspitze der Rektumsonde mit 70 % Alkohol und Weichgewebetüchern ab, um sie für den nächsten Versuch bereit zu halten.
- Beobachten Sie die Maus weiterhin im Bergungskäfig, bis sie ihre normale Aktivität (Gehen, Putzen usw.) wieder aufnimmt, bevor Sie die Maus in ihren Heimatkäfig zurückbringen. Dies markiert das ENDE des Versuchs für diese Maus.
- Notieren Sie den Status des Tieres nach dem Assay – lebend und genesen aus der Testsitzung oder tot. Hochintensive Anfälle mit unkontrolliertem Springen und generalisierten tonischen/klonischen Anfällen können manchmal zum Tod der Maus führen.
- Wenn eine Maus innerhalb des 30-minütigen Beobachtungszeitraums keine hitzeinduzierten Anfälle erleidet oder die Körpertemperatur der Maus 44 °C erreicht, nehmen Sie die Maus aus der Wärmekammer und legen Sie sie auf das Kühlkissen, bis die Körpertemperatur der Maus wieder auf 36-37 °C zurückkehrt.
- Setzen Sie die Temperatur der Wärmekammer der Maus auf 50 °C zurück und lassen Sie sie ausgleichen, bis die Anzeigetemperatur auf dem digitalen Temperaturregler 50 °C anzeigt.
- Wechseln Sie die Kolbenbettung zwischen den einzelnen Mausversuchen.
