Alle Verfahren, bei denen Tierproben verwendet werden, wurden von der zuständigen Kommission für die ethische Überprüfung der Tiere überprüft und genehmigt.
1. Färbung des Primärantikörpers und des Biocytins
(Tag 1)
HINWEIS: Das folgende Immunfärbeverfahren gilt für frei schwebende Abschnitte und erfordert ein kontinuierliches Schütteln bei niedriger Drehzahl (2 Umdrehungen/min, U/min) auf einem Schüttler für alle Inkubationsschritte.
- Waschen Sie das Tuch 3x für je 10 min in 0,1 M PBS (pH = 7,4).
HINWEIS: 0,1 M PBS kann wie folgt kommerziell gekauft oder im Labor hergestellt werden (ergibt 1 L): 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na2HPO4 und 0,24 g KH2PO4 in 1 L dH2O.
HINWEIS: Wenn der gewünschte neurochemische Marker bekannt ist, kann die Färbung für ein Protein/Peptid gleichzeitig mit der Biocytin-Färbung (Schritte 1.2 - 1.4) durchgeführt werden. Wenn Sie nur für Biocytin färben, fahren Sie mit Schritt 1.5 fort.
- OPTIONAL: Mit 10% Blocking Serum (BS; normales Ziegenserum (NGS) verdünnt in 0,3% Triton X-100 in PBS für 1 h bei RT).
HINWEIS: Jede Vertiefung sollte das gleiche Volumen der Lösung erhalten; Das empfohlene Volumen liegt zwischen 250 - 500 μL/Well. Die Auswahl des blockierenden Serums basiert auf der Spezies, in der die Sekundärantikörper aufgezogen sind (z.B. NGS wird für Farbstoff-konjugierte Ziegen-Anti-(jeweilige Primärantikörper-Spezies)) verwendet). Wenn es erforderlich ist, Sekundärantikörper zu verwenden, die in verschiedenen Spezies für Immunfärbeschnitte gezüchtet wurden, sind 10 % jedes normalen Serums in den Blockierungsschritt (2) und 3 % jedes normalen Serums in die Inkubationsschritte der primären und sekundären Antikörper einzuschließen.
- (FAKULTATIV) Inkubieren Sie die Abschnitte im primären Antikörper CB1R (polyklonal, Meerschweinchen) mit 0,3 % Triton X-100 und 3 % BS in 0,1 M PBS bei RT O/N. CB1R wird verwendet, um die Expression des Cannabinoidrezeptors Typ 1 zu identifizieren.
HINWEIS: Dieser Schritt ist optional und nicht erforderlich, um die Biocytin-Füllung freizulegen. Abbildung 2 zeigt einen Abschnitt, der für Biocytin und CB1R während des ersten Färbeprozesses beschriftet ist. Die O/N-Inkubation bei RT ist für die meisten Primärantikörper ausreichend; bestimmte Primärantikörper, einschließlich CB1R, benötigen jedoch eine Inkubation von 3 bis 5 Tagen. Wenn die Inkubation länger als 1 Tag dauern muss, wird empfohlen, bei 4 °C zu inkubieren, da Triton X-100 Scheiben permeabilisieren kann und bei längerer Inkubation bei Raumtemperatur zum Zerfall des Gewebes führen kann. Eine Negativkontrolle, der in mindestens einem Abschnitt für jede Versuchsreihe ein Primärantikörper fehlt, ist als Kontrolle für die Spezifität des Sekundärantikörpers einzubeziehen. Bei Negativkontrollen wird der primäre Antikörper weggelassen, aber die 0,3% Triton X-100 in 0,1 M PBS und BS werden hinzugefügt.
(Tag 2)
- Waschen Sie die Gehirnabschnitte 3x für jeweils 10 min in 0,1 M PBS (pH = 7,4).
- Die Schnitte in Streptavidin-Rot-Farbstoffkonjugat (Konzentration: 1:1.000; Anregung: 594 nm mit Emission im sichtbaren roten Spektrum) werden mit 0,3 % Triton X-100 und 3 % BS in 0,1 M PBS bei 4 °C O/N im Dunkeln (in Aluminiumfolie eingewickelt) inkubiert, um das Biocytin freizulegen. OPTIONAL: Fügen Sie einen Sekundärantikörper hinzu, Ziegen-Anti-Meerschweinchen (Konzentration: 1:500; Anregung: 488 nm und Emission in grün), wobei die obige Inkubation auf die optionale primäre Inkubation in Schritt 1.3 folgt.
HINWEIS: Ein Sekundärantikörper wird nur benötigt, wenn die optionale Primärantikörperfärbung (Schritt 1.3) durchgeführt wird. Zur Visualisierung von Biocytin wird ein Streptavidin-Fluorophor-Konjugat mit einem Emissionsspektrum in Rot empfohlen, da es hilft, feinere Axone detailliert und kontrastreicher darzustellen (Abbildungen 1 - 3).
(Tag 3)
- Waschen Sie die Gehirnabschnitte 3x für jeweils 10 min in 0,1 M PBS (pH = 7,4).
- Um die Fluoreszenz zu schützen und eine spätere Nachfärbung zu erleichtern, montieren Sie die Abschnitte in ein wässriges Eindeckmedium und versiegeln Sie die Ränder des Deckglases mit Klarlack.
HINWEIS: Es ist am besten, Abschnitte so früh wie möglich zu restaurieren, um Schwierigkeiten beim Entfernen des Nagellacks von der Objektträger, Schimmelbefall und Gewebeaustrocknung aufgrund des Austretens des Eindeckmediums aus der Glasschiene zu vermeiden. Eine mikrobielle Kontamination kann durch die Verwendung von 0,02 % Natriumazid in PBS verhindert werden.
VORSICHT: Natriumazid ist hochgiftig und brennbar, wenn es mit Wasser in Berührung kommt. Bitte beachten Sie die Standardarbeitsanweisungen für den Umgang und die Entsorgung gefährlicher Chemikalien.
(Tage 4 - 7)
- Führen Sie eine konfokale Bildgebung mit Anregung bei 594 und 488 nm und einer 20- oder 40-fachen Vergrößerung durch, um biocytingefüllte Neuronen in rot und neurochemische Marker (CB1R) in grün zu zeigen. Bewerten Sie die Co-Labeling (Abbildung 2).
- Stellen Sie die Kamerabelichtung auf weniger als 100 ms ein, um Photobleaching zu vermeiden und konfokale Bildstapel der axonalen und dendritischen Dorne des gesamten Neurons zu erhalten. Verwenden Sie konfokale Bildstapel und Softwarepakete zur Neuronenverfolgung, um die neuronale Morphologie zu rekonstruieren.
