1. Vorbereitung der rektalen Absaugbiopsien (RSB) Schnitte
- Legen Sie die rektalen Absaugbiopsien für 6 h in 4% Paraformaldehyd, um das Gewebe zu fixieren. Verwenden Sie ein Fixiermittelvolumen, das 5-mal höher ist als das Gewebevolumen.
- Dehydrieren Sie das Gewebe mit dem pathologischen Gewebedehydrator für 11 Stunden. Der gesamte programmierte Prozess besteht aus den folgenden 5 Schritten:
- Legen Sie das Taschentuch in Formaldehyd und fixieren Sie es für 1 h.
- Legen Sie das Taschentuch 4 h lang in 75%iges Ethanol.
- Legen Sie das Tuch in absolutes Ethanol (zwei Wechsel à 1 h).
- Legen Sie das Tuch in absolutes Ethanol (zwei Wechsel à 30 min).
- Legen Sie das Gewebe in Xylol (drei Wechsel à 1 h).
- Legen Sie das Taschentuch in Paraffinwachs (58-60 °C) (drei Wechsel à 1 h). Betten Sie das RSB-Gewebe in Paraffinblöcke ein.
- Schneiden Sie die Paraffinblöcke mit einem Mikrotom ab, bis das Gewebe vollständig mit einer vollständigen Schnittebene freigelegt ist.
- Schneiden Sie die Blöcke mit einem Mikrotom in 0,4 μm große Abschnitte.
- Legen Sie die Abschnitte jeweils für einige Sekunden in 45-50 °C warmes Wasser, damit sich die Abschnitte auf einer flachen Platte verteilen können.
- Übertragen Sie die Paraffinabschnitte auf Objektträger.
- Die Dias im 60 °C Backofen 3-5 h backen. Vermeiden Sie zu langes Backen, da dies zum Verlust der Antigene führen kann.
- Legen Sie die entparaffinisierten Objektträger in Xylol (2 Wechselvorgänge à 15 min).
- Hydratisieren Sie die Objektträger jeweils 5 Minuten lang in absolutem Ethanol, 95 %, 80 % und 75 % Ethanol. Spülen Sie sie dann weitere 5 Minuten lang in Umkehrosmose (RO)-gereinigtem Wasser ab.
2. Antigen-Retrieval
- Nehmen Sie Arbeitsverdünnungen für die Calretinin-Rückgewinnung vor, indem Sie 4 ml Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)-Antigen-Rückgewinnungspuffer mit 200 ml RO-gereinigtem Wasser mischen. Nehmen Sie Arbeitsverdünnungen für die Entnahme von S100 und Protein-Genprodukt 9.5 (PGP9.5) vor, indem Sie 1 ml Zitronensäure-Natriumcitrat-Puffer (100x) mit 99 ml RO-gereinigtem Wasser mischen.
HINWEIS: Calretinin kann bevorzugt durch EDTA-Rückhollösung gewonnen werden. Zitronensäure-Natriumcitrat-Puffer ist jedoch besser für die Gewinnung von S100 und PGP9.5 geeignet.
- Legen Sie die Objektträger in ein Coplin-Färbeglas. Füllen Sie das Glas mit Rückhollösung und stellen Sie es in ein vorgeheiztes kochendes Wasserbad. Nach 20 Minuten Kochen das Glas aus dem Wasserbad nehmen und auf Zimmertemperatur abkühlen lassen. Der Kühlvorgang dauert ca. 10 min. Entfernen Sie die Objektträger und spülen Sie sie einmal vorsichtig mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) aus.
- Zeichnen Sie mit einem Filzstift einen Kreis um das Taschentuch und bereiten Sie eine Nassbox für die folgenden Eingriffe vor.
3. Blockieren
- Nehmen Sie Arbeitsverdünnungen vor, indem Sie 3 mL 30 % H2O2 mit 27 mL RO-gereinigtem Wasser mischen.
- Tropfen Sie zwei oder drei Tropfen 3% H2O2 Lösung tropfenweise auf das Gewebe, um die Peroxidasen zu blockieren. Fügen Sie die Lösung H2O2 sofort hinzu, um sicherzustellen, dass sie nicht aus dem Kreis überläuft. Peroxidasen in einem 37 °C Inkubator für 20 min blockieren.
- Spülen Sie die Objektträger vorsichtig mit PBS aus (drei Wäschen à 5 min).
- Blockieren Sie die Objektträger 20 Minuten lang bei 37 °C mit 5 % Rinderserumalbumin (BSA, hergestellt durch Mischen von 1,5 g BSA-Pulver mit 30 ml RO-gereinigtem Wasser).
HINWEIS: Die Blockierung mit 3 % Wasserstoffperoxid kann 95 % der unspezifischen Färbungen verhindern, und die Blockierung mit 5 % BSA kann die anderen 5 % der unspezifischen Färbung verhindern. Kombinieren Sie die beiden Methoden, um ein zuverlässiges Ergebnis zu erhalten.
4. Antigen-Antikörper-Reaktion
- Entfernen Sie das 5%ige BSA und geben Sie 50 μl primären Antikörper (Calretinin, S100 oder PGP9.5) in den Objektträger. Über Nacht bei 4 °C inkubieren.
- Waschen Sie den Objektträger mit PBS (dreimal à 3 min).
- Geben Sie 50 μl Polymerverstärker (Reagenz A; siehe Table of Materials) in den Abschnitt und inkubieren Sie es 20 Minuten lang in einem 37 °C Inkubator. Waschen Sie dann den Objektträger mit PBS (dreimal à 3 min).
- Geben Sie 50 μl Sekundärantikörper B (Ziegen-Anti-Kaninchen/Maus-IgG-Sekundärantikörper) in den Schnitt und inkubieren Sie ihn 30 Minuten lang in einem 37 °C-Inkubator. Waschen Sie die Partie mit PBS (dreimal à 5 min).
5. 3,3-Diaminobenzidin- und Hämatoxylin-Färbung
- Geben Sie 850 μl RO-gereinigtes Wasser in ein 1,5-ml-Röhrchen und fügen Sie die Färbereagenzien (siehe Tabelle der Materialien) in der Reihenfolge A, B und C hinzu. Fügen Sie 50 μl jedes Reagenzes hinzu, um insgesamt 1 ml 3,3-Diaminobenzidin (DAB)-Arbeitslösung zu erhalten. Wenn Ausfällungen vorhanden sind, verwenden Sie die Lösung nach der Filtration.
- Geben Sie einen Tropfen DAB-Arbeitslösung in den Gewebeschnitt und färben Sie ihn 3-10 Minuten lang. Inkubieren Sie die Objektträger in DAB bei Raumtemperatur, bis eine Braunfärbung festgestellt wird. Überwachen Sie vorsichtig mit einem Hellfeldmikroskop. Halten Sie die DAB-Arbeitslösung von Licht fern. Waschen Sie dann den Objektträger 5 Minuten lang mit PBS.
- Fügen Sie einen Tropfen Hämatoxylin hinzu, um die Zellkerne etwa 1 Minute lang gegenzufärben. Halten Sie dann das Coplin-Glas fest und waschen Sie es unter einem Rinnsal Wasser für ca. 30-40 s, bis der überschüssige Farbstoff entfernt ist. Achten Sie darauf, die Gewebeabschnitte nicht zu beschädigen.
- Tauchen Sie die RSB-Objektträger 25-30 s lang in ein Coplin-Glas, das PBS enthält. Differenzieren Sie dann 10 s lang in 1% Salzsäure-Ethanol. Waschen Sie die Objektträger 1 Min. lang mit PBS.
- Dehydrieren Sie die Objektträger in umgekehrter Reihenfolge der Hydratation: 75 %, 80 %, 95 % und absolutes Ethanol (jeweils 5 Minuten).
- Setzen Sie die Objektträger Xylol aus (2 Wechsel à 5 min).
- Montieren Sie das Deckglas mit der Ultraclean-Montage. Lassen Sie die Objektträger trocknen, bevor Sie sie mit einem Mikroskop visualisieren.