Alle Verfahren mit Tierproben wurden von der zuständigen Kommission für ethische Überprüfung der Tiere überprüft und genehmigt.
1. Herstellung von Dissektionslösungen und künstlichem Liquor
- Karbogenats Reinstwasser (d.h. Wasser, das mit einem spezifischen Widerstand von 18,2 MΩ·cm gefiltert wurde) mit Carbogen (95% O2/5% CO2) für 5 min unter Verwendung von Ausströmer-Bubble-Diffusoren (Belüfter für Aquarien).
Hinweis: Ausströmersteine können über Standard-Silikonschlauch mit dem Regler des Carbogen-Tanks verbunden werden. Wenn keine Ausströmersteine verfügbar sind, versiegeln Sie das Ende des Silikonschlauchs und stechen Sie kleine Löcher in die Dichtung, damit das Carbogengas austreten und die Lösung carbogenisieren kann.
- Bereiten Sie eine Sezierlösung vor, indem Sie die gelösten Bestandteile aus Tabelle 1 in Reinstwasser auflösen. Fügen Sie CaCl2 zu einer Lösung hinzu, die mindestens 5 Minuten lang karbogenisiert wurde, damit sie sich auflöst.
Hinweis: Alternativ können Sie zuerst CaCl2 hinzufügen, damit es sich in einer ungesättigten Lösung leicht auflösen kann. Die Lösung in flüssiger Form sollte 300 - 320 mOsm/L haben und einen pH-Wert von 7,4 haben, nachdem sie mit Carbogen gesättigt wurde.
- Die Sezierlösung auf 0 - 4 °C kalt stellen. Lassen Sie die Lösung über Nacht im Kühlschrank oder stellen Sie die Lösung für 1 h in den Gefrierschrank und überwachen Sie kontinuierlich die Temperatur.
Hinweis: Die Sezierlösung kann bis zu 3 Nächte gelagert werden; Danach verwerfen.
- Carbogenatisieren Sie die Separierlösung für 5 - 10 min vor Gebrauch.
Hinweis: Im Idealfall sollte die Lösung entweder als Matsch erscheinen oder vor der Verwendung in Matsch übergehen.
- Bereiten Sie künstliche Zerebrospinalflüssigkeit (ACSF) für Nagetiere vor, indem Sie die gelösten Bestandteile aus Tabelle 2 in Reinstwasser auflösen. Carbogenatisieren Sie die ACSF-Lösung, während sie sich bis zur Verwendung in einem auf 35 °C erhitzten Wasserbad befindet. Fügen Sie CaCl2 zu einer Lösung hinzu, die mindestens 5 Minuten lang carbogenisiert wurde, damit sie sich auflöst.
Hinweis: Alternativ können Sie zuerst CaCl2 hinzufügen, damit es sich in einer ungesättigten Lösung leichter auflösen kann. Die Lösung in flüssiger Form sollte 290 - 320 mOsm/L haben und einen pH-Wert von 7,4 haben, nachdem sie mit Carbogen gesättigt wurde. Die Lösungen sollten je nach Dauer der Experimente in Volumina von 1, 2 oder 4 l hergestellt werden. Machen Sie 4 L für einen ganzen Tag (8 Stunden) voller Experimente. Der ACSF sollte jeden Tag frisch zubereitet werden; Lagern Sie es nicht länger als 1 Tag.
2. Maus-Dissektion zur Entnahme von Hirngewebe
- Sammeln Sie alle Werkzeuge und Materialien, die für das Sezieren von Tieren erforderlich sind. Richten Sie den Arbeitsbereich so ein, dass Sie sich auf das Sezieren von Tieren vorbereiten.
- Überprüfen Sie den Carbogen-Tank (95%O2/5%CO2), um sicherzustellen, dass er nicht leer ist. Tauschen Sie die Gasflasche vor den Experimenten aus, wenn weniger als 500 psi Druck verbleibt.
- Kalibrieren Sie das Vibratom (Vibrationsklingen-Tissue-Slicer) gemäß der Bedienungsanleitung des Herstellers. Passen Sie die Vibrationseinstellung so an, dass sie eine Schnittamplitude von 1 mm und eine Schnittgeschwindigkeit von 0,12 mm/s hat.
Hinweis: Die optimalen Einstellungen können für jeden einzelnen vibrierenden Tissue-Klingenschneider unterschiedlich sein; Im Allgemeinen sollte die Amplitude jedoch hoch und die Schnittgeschwindigkeit niedrig sein.
- Füllen Sie die Inkubationskammer der Gehirnscheibe (d.h. , der Hüter der Gehirnscheibe) mit ACSF und blasen Sie sie mit Carbogen. Stellen Sie dann die Inkubationskammer in ein auf 35 °C eingestelltes Wasserbad.
- Besorgen Sie sich eine juvenile Maus beiderlei Geschlechts im Alter zwischen 13 Tagen (p13) und 21 Tagen (p21, wobei p0 das Geburtsdatum ist).
- Betäuben Sie die Maus mit einer intraperitonealen Injektion von Natrium-Pentobarbital (55 mg/kg Körpergewicht). Sobald die Maus tief betäubt ist, was durch das Fehlen des Zehenklemmreflexes angezeigt wird, verwenden Sie sofort ein vom Tierarzt zugelassenes Guillotine-Instrument, um die Maus mit einer schnellen Bewegung zu enthaupten.
Hinweis: Bereiten Sie die Natrium-Pentobarbital-Injektion gemäß den von den institutionellen Richtlinien empfohlenen Verfahren vor.
- Halten Sie die Nase der Maus fest, um den enthaupteten Kopf zu stabilisieren, und machen Sie vorsichtig einen Schnitt in der Mittellinie, beginnend zwischen den Augen der Maus und über die gesamte Länge der Kopfhaut, um den Schädel freizulegen. Achte darauf, dass der Schädel durch den Druck des Rasierers nicht zusammengedrückt wird. Verwenden Sie die Ecke der Rasierklinge, um die Schnittpräzision zu erhöhen.
- Spreizen Sie die Lappen der Kopfhaut der Maus mit den Fingern, um den Schädel freizulegen. Verwenden Sie dann die frische Ecke einer Rasierklinge, um einen Schnitt entlang der Mittellinie des Schädels zu machen. Achten Sie darauf, jeglichen Kontakt mit der Großhirnrinde zu vermeiden.
- Führen Sie eine Splitterzange in die Augenhöhlen der Maus ein, um den geköpften Kopf zu stabilisieren, und legen Sie ihn in eine Petrischale, die mit kalter (0 - 4 °C) Sezierlösung gefüllt ist. Stellen Sie sicher, dass der Kopf vollständig in die Sezierlösung eingetaucht ist.
- Verwenden Sie eine zweite Splitterzange, um die Kopfhaut der Maus vorsichtig abzuschälen, entfernen Sie das Nasenknochen, indem Sie es schälen, und entfernen Sie die Rückseite (kaudale Seite) des Schädels.
Hinweis: Das Nasenbein von jungen Mäusen ist sehr weich und kann leicht gebrochen werden.
- Verwenden Sie einen Mikrospatel, um die Sehnerven, Trigeminusnerven und das Rückenmark zu durchtrennen. Trennen Sie dann mit dem Mikrospatel vorsichtig das Gehirn vom Schädel. Lassen Sie das Gehirn vollständig in die mit Sezierlösung gefüllte Petrischale eintauchen.
3. Präparation von kortikalen Schnitten aus dem somatosensorisch-motorischen Kortex
- Füllen Sie die Pufferschale des Vibratoms mit ~150 mL kalter (0 - 4 °C) Dissektionslösung.
Hinweis: Optional können Sie die Pufferschale bis zur Verwendung im Gefrierschrank aufbewahren, um während des Schneidens eine niedrige Temperatur aufrechtzuerhalten.
- Kleben Sie das Hirngewebe der Maus mit Sekundenkleber auf den Vibrationstisch (Probenhalter/Tablett). Bei Mäusen schneidet man einen kleinen kaudalen Teil des Gehirns ab (, d.h. , das Kleinhirn), so dass er leicht flach auf den Probenhalter geklebt werden kann (so dass die rostrale Seite des Gehirns zur Decke zeigt).
Hinweis: Alternativ können horizontale Schnitte des Maushirns vorbereitet werden, indem die dorsale Seite des Gehirns auf den Probenhalter geklebt wird (die ventrale Seite des Gehirns sollte zur Decke zeigen).
- Setzen Sie den Probenhalter (mit Hirngewebe) vorsichtig in die Pufferschale ein. Stellen Sie sicher, dass der dorsale Teil des Gehirns der Klinge des Vibratoms zugewandt ist.
Hinweis: Es ist wichtig, die Zeit, die das Gehirn der Luft ausgesetzt ist, so gering wie möglich zu halten.
4. Entnahme und Entnahme von Hirngewebe
- Schneiden Sie das Gehirn in 450 μm dicke Scheiben mit dem Vibratom in dorsaler bis ventraler Richtung. Stellen Sie sicher, dass das Gehirn beim Schneiden vollständig an der Probenschale verankert bleibt.
- Machen Sie den ersten Schnitt im Gehirn der Maus, um den Riechkolben zu entfernen. Nehmen Sie dann weitere Schnitte vor, bis der somatosensomotorische Bereich (der sich etwa auf halbem Weg zwischen dem Riechkolben und dem Bregma befindet) beobachtet wird.
Hinweis: Optional schneiden Sie das Gehirn in dünnere (200 μm) Scheiben, bis das Corpus callosum in der koronalen Ansicht des Gehirns erscheint, was darauf hinweist, dass der somatosensorisch-motorische Bereich nahe ist.
- Verwenden Sie eine Transferpipette mit breiter Bohrung, um koronale Schnitte (450 μm) zu sammeln, die den somatosensorisch-motorischen Bereich enthalten, und tauchen Sie sie in eine Petrischale mit kalter (0 - 4 °C) Dissektionslösung.
- Verwenden Sie eine neue Rasierklinge und schneiden Sie überschüssiges Gewebe von den Scheiben ab. Für koronale Schnitte von Mäusen führen Sie einen Querschnitt direkt unterhalb der neokortikalen Kommissur durch (d.h. , Corpus callosum). Schneiden Sie nicht in einer Sägebewegung; Üben Sie einfach Druck auf die Klinge in das Taschentuch aus und verwenden Sie eine Detailbürste, um das Gewebe vorsichtig zu trennen. Achten Sie darauf, die Bewegung des koronalen Schnitts zu minimieren.
- Verwenden Sie eine Transferpipette mit breiter Bohrung, um den dorsalen Teil der koronalen Schnitte, die den Neokortex enthalten (Schicht 1 - 6), für einen Moment (~1 s) in eine zweite Petrischale zu übertragen, die mit warmem (35 °C) ACSF gefüllt ist. Bringen Sie die Scheiben dann umgehend in eine Inkubationskammer mit warmem (35 °C) carbogeniertem ACSF.
Hinweis: Der Zweck des Transfers in die Petrischale mit ACSF besteht darin, den Transfer der Dissektionslösung in die Inkubationskammer zu minimieren, während Gehirnschnitte mit der Pipette mit breiter Öffnung übertragen werden. Nutzen Sie die mehreren Vertiefungen der Inkubationskammer, um die verschiedenen Gehirnschnitte zu organisieren.
- Entsorgen Sie den Rest des Gehirns und den Tierkadaver gemäß den institutionellen Richtlinien.
5. Inkubation und Wartung
- Lassen Sie die Gehirnscheiben 30 min lang leicht in die Inkubationskammer bei 35 °C eintauchen. Nehmen Sie dann die Inkubationskammer aus dem Wasserbad und lassen Sie sie wieder auf Raumtemperatur (20 - 25 °C) bringen. Warten Sie 1 Stunde, bis sich die Gehirnschnitte erholt haben, bevor Sie elektrophysiologische Aufzeichnungen durchführen.
Hinweis: Stellen Sie sicher, dass sich keine Luftblasen unter den Gehirnschnitten in der Inkubationskammer ansammeln. Luftblasen sind Luftgrenzflächen, die Gewebeschäden verursachen. Die Schnitte des Mausgehirns können 6 - 8 h in einer gut karbogenierten Inkubationskammer mit ACSF aufbewahrt werden.
6. Elektrophysiologische Aufzeichnungen der oberflächlichen kortikalen Schicht
Hinweis: Iktale Ereignisse werden in den extrazellulären LFP-Aufzeichnungen (Local Field Potential) von Hirnschnitten beobachtet. Der LFP des Hirnschnitts kann entweder mit einer Grenzflächenkammer oder einem submersen Multi-Elektroden-Array-System (MEA) beobachtet und aufgezeichnet werden.
- Verwenden Sie eine Transferpipette mit breiter Bohrung oder einen Detaillierungspinsel, um eine Gehirnscheibe auf etwas größeres, vorgestanztes Linsenpapier zu verschieben, das mit einer Zahnpinzette an Ort und Stelle gehalten wird. Übertragen Sie das Linsenpapier (auf dem die Gehirnscheibe ruht) in die Aufnahmekammer und befestigen Sie es mit einem Harfensieb.
- Lassen Sie das carbogenierte ACSF-Perfusat warm (35 °C) mit einer Geschwindigkeit von 3 ml/min (~1 Tropf/s) durch die Aufnahmekammer über die Gehirnscheibe laufen. Verwenden Sie ein digitales Thermometer, um sicherzustellen, dass die Aufzeichnungskammer 33 - 36 °C hat.
- Glaselektroden mit einer Impedanz von 1 - 3 MΩ aus Borosilikatglasröhren (mit einem Außendurchmesser von 1,5 mm) mit einem Abzieher ziehen. Füllen Sie die Glaselektroden mit ACSF (~10 μL) mit einer Hamilton-Spritze auf. Entsorgen Sie die Elektrode sofort, wenn die Spitze beschädigt ist.
Hinweis: Bleichen Sie den Silberdraht (5 min) und lassen Sie nur einen minimalen Teil (, d.h. , die Spitze) des Silberdrahtes in die hinterfüllten ACSF-Glaselektroden eintauchen, um Rauschen und Drift während der Aufnahmen zu minimieren. Entfernen Sie bei Bedarf überschüssige ACSF von der Glaselektrode mit einer Hamilton-Spritze.
- Verwenden Sie ein 20-faches Stereomikroskop, um die Aufzeichnungsglaselektrode mit manuellen Manipulatoren genau in die oberflächliche kortikale Schicht (2/3) zu führen. Aufzeichnen/Anzeigen der elektrischen Aktivität des Hirnschnitts auf einem Computer mit Standardsoftware.
Hinweis: Lebensfähige (qualitativ hochwertige) Hirnschnitte zeigen ein robustes evoziertes Potential als Reaktion auf die angelegten elektrischen Stimuli (100 μs, 30 - 300 μA) oder Lichtimpulse (30 ms, 10 mW/mm2) für optogenetisches Gewebe.
7. Induktion anfallsähnlicher Aktivitäten
- Perfusion ACSF mit 100 μM 4-Aminopyrimidin (4-AP) über dem Hirnschnitt. 80 mg 4-AP in 8,5 mL Wasser auflösen, um eine Stammlösung von 100 mM 4-AP herzustellen. 100 μl 100 mM 4-AP Stammlösung zu 100 mL ACSF hinzufügen, um ein ACSF-Perfusat mit 100 μM 4-AP zu erhalten.
Hinweis: Alternativ können Sie Zero-Mg2+ ACSF (Table 3) verwenden, eine modifizierte ACSF-Lösung, die kein zugesetztes Mg2+ enthält, um den Hirnschnitt zu perfundieren. Die durchschnittliche Zeit, bis iktale Ereignisse erscheinen, beträgt 15 Minuten. Bei einigen Hirnschnitten kann es jedoch bis zu 40 Minuten dauern.
8. On-Demand-Anfallsgenerierung: eine optogenetische Strategie für optogenetische Mäuse
- Wenden Sie einen kurzen (30 ms) Impuls aus blauem Licht (470 nm) an (mit einer Ausgangsintensität von mindestens 1 mW/mm2), um ein iktales Ereignis zu initiieren. Verwenden Sie einen manuellen Manipulator, um eine optische Faser mit einem Kerndurchmesser von 1.000 μm (0,39 NA) direkt über dem Aufnahmebereich zu positionieren.
Hinweis: Stellen Sie die Rate der Photostimulation so ein, dass sie der gewünschten Rate des Auftretens des iktalen Ereignisses entspricht (d.h. , 1 Impuls alle 50 s). Die Rate kann jedoch nicht übertrieben von der intrinsischen Rate abgeleitet werden, mit der iktale Ereignisse auftreten.
Tabelle 1: Rezept für die Sezierlösung. Dies sind Anweisungen, um 1 L oder 2 L Volumen herzustellen. MW = das Molekulargewicht des gelösten Stoffes.
| # | Reagenz | Konz. [mM] | MW (g/mol) | 1L (g) | 2L (g) |
| 1 | Saccharose | 248 | 342,3 | 84.89 | 169,78 |
| 2 | Natriumbicarbonat (NaHCO2) | 26 | 84.01 | 2.18 | 4,37 |
| 3 | Dextrose (D-Glukose) | 10 | 180,16 | 1.8 | 3.6 |
| 4 | Kaliumchlorid (KCl) | 2 | 74,55 | 0.15 | 0.3 |
| 5 | Magnesiumsulfat (MgSO4·7H2O) | 3 | 246,47 | 0.74 | 1.48 |
| 6 | Monobasisches Natriumphosphat-Monohydrat (H2NaPO4·H2O) | 1,25 | 137,99 | 0.17 | 0.34 |
| 7 | Calciumchlorid (CaCl2·2H2O) | 1 | 147,01 | 0.15 | 0,29 |
Tabelle 2: Rezept für künstliche zerebrale Rückenmarksflüssigkeit (ACSF) von Nagetieren. Dies sind Anweisungen, um 2 L oder 4 L Volumen zu erstellen. MW = das Molekulargewicht des gelösten Stoffes.
| # | Reagenz | Konz. [mM] | MW (g/mol) | 2L (g) | 4L (g) |
| 1 | Natriumchlorid (NaCl) | 123 | 58,4 | 14,37 | 28,73 |
| 2 | Natriumbicarbonat (NaHCO2) | 26 | 84.01 | 4.37 | 8.74 |
| 3 | Dextrose (D-Glukose) | 10 | 180,16 | 3.6 | 7.21 |
| 4 | Kaliumchlorid (KCl) | 4 | 74,55 | 0.6 | 1.19 |
| 5 | Magnesiumsulfat (MgSO4·H2O) | 1.3 | 246,47 | 0,64 | 1.28 |
| 6 | Monobasisches Natriumphosphat-Monohydrat (HNaPO4·H2O) | 1.2 | 137,99 | 0.33 | 0.66 |
| 7 | Calciumchlorid (CaCl2·2H2O) | 1.5 | 147,01 | 0,44 | 0,88 |
Tabelle 3: Rezept für Zero-Mg2+ Nagetier-Gelenkmarksflüssigkeit (Zero-Mg2+ ACSF). Dies sind Anweisungen, um 2 L oder 4 L Volumen zu erstellen. MW = das Molekulargewicht des gelösten Stoffes.
| # | Reagenz | Konz. [mM] | MW (g/mol) | 2L (g) | 4L (g) |
| 1 | Natriumchlorid (NaCl) | 123 | 58,4 | 14,37 | 28,73 |
| 2 | Natriumbicarbonat (NaHCO2) | 26 | 84.01 | 4.37 | 8.74 |
| 3 | Dextrose (D-Glukose) | 10 | 180,16 | 3.6 | 7.21 |
| 4 | Kaliumchlorid (KCl) | 4 | 74,55 | 0.6 | 1.19 |
| 5 | Magnesiumsulfat (MgSO4·H2O) | Nominell frei | 246,47 | 0 | 0 |
| 6 | Monobasisches Natriumphosphat-Monohydrat (HNaPO4·H2O) | 1.2 | 137,99 | 0.33 | 0,66 |
| 7 | Calciumchlorid (CaCl2·2H2O) | 1,5 | 147,01 | 0,29 | 0,59 |