Etablierung eines Pentylentetrazol-induzierten epileptischen Anfallsmodells bei Mäusen

Zusammenfassung

Quelle: Shimada, T., et al. Pentylentetrazol-induziertes Kindling-Mausmodell. J. Vis. exp. (2018).

Dieses Video zeigt den Prozess der Induktion von Epilepsie bei Mäusen mit Pentylentetrazol (PTZ)-Injektionen, einem GABA-A-Rezeptor-Antagonisten. Die wiederholte intraperitoneale Verabreichung von PTZ senkt die Anfallsschwelle progressiv, indem sie den Einstrom von Chloridionen hemmt, die inhibitorische Neurotransmission stört und zu einer Übererregbarkeit in Neuronen führt, die Anfälle auslösen. Dieser Prozess führt zum Anzünden und zur Entwicklung von spontanen Anfällen, die eine chronische Epilepsie nachahmen.

Protokoll

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom örtlichen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

1. Zubereitung von Pentylentetrazol (PTZ)

1. Lösen Sie 2 mg/ml PTZ in sterilem 0,9 % (w/v) NaCl. Bereiten Sie PTZ am Tag der Verwendung vor.

2. Injektion von PTZ

1. Führen Sie alle Experimente zwischen 9:00 Uhr und 12:00 Uhr (mittags) durch.
2. Messen Sie das Körpergewicht des Tieres.
3. Setzen Sie das Tier zur Gewöhnung in eine Beobachtungskammer.
4. Berechnen Sie während der Gewöhnungsphase (3 min) das Volumen der PTZ-Lösung für die Injektion auf der Grundlage des Körpergewichts des Tieres und der zuvor festgelegten Injektionsdosis.
   HINWEIS: Wenn beispielsweise 35 mg/kg PTZ verwendet werden, sind 0,875 mg PTZ für eine Maus mit einem Gewicht von 25 g erforderlich (35 mg/kg x 0,025 kg = 0,875 mg). Daher sollten 437,5 μl einer 2 mg/ml PTZ-Lösung injiziert werden (0,875 mg / 2 mg/ml = 0,4375 ml). Die Injektionsdosis von PTZ hängt vom Genotyp und Stamm der Maus ab. Für Wildtyp-Mäuse mit C57BL/6 wird für den ersten Versuch eine Dosis von 30-35 mg PTZ/kg Körpergewicht empfohlen. Die Empfindlichkeit gegenüber PTZ hängt von der verwendeten Mausbelastung ab. Die Injektionsdosis variiert je nach Zweck des Experiments.
5. Injizieren Sie PTZ intraperitoneal mit einer 1-ml-Spritze, die an einer 27-Gauge-Nadel befestigt ist, in den linken oder rechten Quadranten des Abdomens des Tieres. Vermeiden Sie die Injektion an der Mittellinie.
   1. Vermeiden Sie wiederholte Injektionen an der gleichen Position.
6. Beobachten Sie das Verhalten der Tiere 30 Minuten lang nach der PTZ-Verabreichung (Abbildung 1A) und klassifizieren und bewerten Sie das abnormale Verhalten wie unten gezeigt. Wenn möglich, sollten die Tiere 24 Stunden oder mindestens weitere 6-10 Stunden nach der Injektion unter Beobachtung gehalten werden, insbesondere wenn der Schweregrad der Anfälle 3 oder mehr erreicht.
   1. Notieren Sie leichte Krampfanfälle oder Verhaltensänderungen bei den Tieren über den 30-minütigen Beobachtungszeitraum hinaus. Dieser verlängerte Beobachtungszeitraum könnte sich mit einer besonders wichtigen und vollständigen Wirkung einer subkonvulsiven Dosis von PTZ bei der Entstehung chronischer unprovozierter Anfälle bei Epilepsie befassen.
   2. Messen Sie außerdem die Anfallsdauer jedes beobachteten Anfalls, da sich Änderungen der Anfallsdauer auf die Schwere des Anfalls beziehen. Darüber hinaus ist die Latenz bis zum ersten Anfall nach der PTZ-Injektion ein weiteres wichtiges Maß, das es zu erfassen gilt. Die Überwachung der Häufigkeit, Dauer und Latenz von Anfällen ist für alle molekularen Studien nach Anfällen von entscheidender Bedeutung.
7. Injizieren Sie PTZ jeden zweiten Tag (Abbildung 1A). Die Anzahl der Injektionen hängt vom Ziel des Versuchs ab. Repräsentative Beispiele sind wie folgt.
   1. Um vollständig entzündete Tiere zu erzeugen, wird die Injektion, sobald ein Tier einen Anfall mit einem Score von 5 (tonisch-klonischer Anfall) erleidet, innerhalb von drei weiteren Verabreichungen beendet. Erhöhen Sie in diesem Fall die Injektionsdosis, wenn der Anfallswert bei drei aufeinanderfolgenden Verabreichungen nicht ansteigt. Jedes Tier kann eine andere Anzahl und Dosis von PTZ-Injektionen erhalten.
   2. Bestimmen Sie die Anzahl und Dosis der PTZ-Injektion unter allen Bedingungen, um die Anfälligkeit für PTZ zu bewerten, einschließlich bei der Bewertung von Anti-Epilepsie-Medikamenten und Studien zum Phänotyp genetisch veränderter Mäuse. Geben Sie allen Tieren die gleiche Anzahl von PTZ-Injektionen; Insgesamt werden 8 bis 12 Injektionen empfohlen. Wenn ein Tier stirbt, sollte der Anfallswert mit 6 angegeben werden.
   3. Bestimmen Sie die Injektionsdosis, die erforderlich ist, um einen hohen Anfallswert (4 oder 5) für 10 oder mehr Injektionen aufrechtzuerhalten, um die histopathologischen Veränderungen zu untersuchen, die bei epileptischen Anfällen auftreten. In diesem Fall sollte die Gesamtinjektionszahl zwischen 25 und 30 liegen. Verringern Sie die Injektionsdosis, wenn der Anfallswert 5 erreicht. Wenn der Anfallswert auf 3 oder niedriger sinkt, erhöhen Sie die Injektionsdosis.

Ergebnisse

Abbildung 1: Kurze Beschreibung des Protokolls. (A) Schematische Darstellung von PTZ-vermitteltem Anzünden. (B) Illustrationen repräsentativer Tierverhaltensweisen für die jeweiligen Anfallswerte.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Pentylentetrazol	Sigma-Aldrich	P6500
Natriumchlorid	MANAC	7647-14-5
Maus	CLEA Japan		C57Bl/6NJcl, postnatal 8 Wochen, männlich
Spritze (1 ml)	Terumo	SS-01T
Nadel (27G x 3/4") (0,40 x 19 mm)	Terumo	NN-2719S
Waage	Mettler	PE2000	Bei diesem Artikel handelt es sich um ein abgekündigtes Produkt. Fast gleichwertig mit FX-2000i mit FXi-12-JA der Firma A&D.