Induktion von Ischämie über einen Verschluss der mittleren Hirn- und Halsschlagader in einem Rattenmodell

Zusammenfassung

Quelle: Wayman, C. et al., Durchführung einer dauerhaften distalen Mittelzerebraloperation mit Verschluss der Arteria carotis bei älteren Ratten zur Untersuchung der kortikalen Ischämie mit anhaltender Behinderung. J. Vis. Exp. (2016)

Dieses Video zeigt das Verfahren der Durchführung eines permanenten distalen Verschlusses der mittleren Hirnarterie (MCAO) mit der Arteria carotis communis (CCA) bei gealterten Ratten, um einen ischämischen Schlaganfall zu modellieren. Dies blockiert den Blutfluss zum Gehirn, was zum neuronalen Tod führt und ein Modell zur Untersuchung von Schlaganfallmechanismen und möglichen Behandlungen erstellt.

Protokoll

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom örtlichen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

1. Chirurgie

1. Verwenden Sie weibliche ältere Lister-Hooded-Ratten im Alter von 16-18 Monaten (250 bis 400 g) und leiten Sie eine Anästhesie mit 5% Isofluran in 1,5 l/min O₂ ein. Reduzieren Sie nach Einleitung der Anästhesie den Isofluranspiegel und halten Sie ihn für die Operation auf einer angemessenen, aber minimierten Tiefe (, z. B. , 1,5-2%). Führen Sie dem Tier eine Anästhesie mit einer Gesichtsmaske durch und verwenden Sie ein Scavenging-System, um die Exposition des Chirurgen gegenüber Isofluran zu begrenzen.
   1. Führen Sie alle Eingriffe bis hin zur Kraniotomie bei Scheintieren durch, da diese Prozedur zu Verhaltensdefiziten führen kann. Berücksichtigen Sie experimentelle Ziele bei der Planung von Experimenten zum Verschluss der mittleren Hirnarterie (MCAO) und entscheiden Sie, ob eine Scheingruppe zur Kontrolle der Kraniotomie einbezogen werden soll oder nicht.
2. Verabreichen Sie Schmerzmittel prä- oder perioperativ (Carprieve, 0,25 mg/kg, s. Schnitt).
   1. 1 ml auf 19 ml sterile 0,9%ige Kochsalzlösung zugeben, um die Stammlösung herzustellen, und 0,6 ml pro 300 g Ratte injizieren. Die Verwendung von Carprieve wird Carprofen vorgezogen, da ersteres bei Raumtemperatur (RT) stabil ist.
3. Rasieren Sie das Fell im ventralen Halsbereich und den Schläfenbereich auf der rechten Hemisphäre, um die Haut freizulegen. Desinfizieren Sie die Operationsstellen mit Ethanoltupfern.
   1. Führen Sie diesen Schritt außerhalb des Operationsbereichs durch, um die Fellmenge an der Inzisionsstelle zu minimieren.
4. Legen Sie die Ratte auf eine mit einem sterilen Tuch bedeckte Korkplatte in Rückenlage auf ein Heizkissen. Tragen Sie Lidocain-Creme auf die rasierten Regionen von Kopf und Hals auf. Führen Sie eine rektale Sonde ein, um die Temperatur des Tieres mit einem homöothermen System zwischen 36,5 und 37,5 °C zu überwachen und zu halten.
   1. Tragen Sie Lacrilube-Salbe auf die Augen auf, um ein Austrocknen zu verhindern. Geben Sie der Ratte eine Injektion von Atropinsulfatlösung (0,05 ml einer 600 μg/ml Lösung, subkutan), um die Trachealsekretion zu reduzieren.
      HINWEIS: Forscher sollten die Messung physiologischer Variablen wie Blutgase und Druck in Betracht ziehen.
5. Überprüfen Sie vor Beginn der Operation den Kneif-Entzug der Hinterpfote und die Blinzelreflexe, um die vollständige Anästhesie zu bestätigen.
6. Nehmen Sie unter einem Präpariermikroskop mit einem Skalpell einen 2 cm langen Schnitt in der Mittellinie am freiliegenden Hals vor. Bewegen Sie die Speicheldrüsen auf beiden Seiten sanft seitlich zur Luftröhre.
7. Schlingen Sie eine nicht resorbierbare Seidennaht um die Haut, die auf einer Seite über der Arteria carotis communis liegt. Ziehen Sie die Haut vorsichtig mit der Seidennaht von der Stelle ab und kleben Sie diese mit chirurgischem Klebeband auf die Korkplatte, um die Halsschlagader freizulegen. Präparieren Sie die Arterien vorsichtig stumpf von den umgebenden Faszien und den Vagusnerven mit einer feinen Zange.
   1. Achte darauf, dass du bei diesem Schritt nicht die Muskeln oder Vagusnerven schädigst, da dies das Füttern, Schlucken und Atmen beeinträchtigt.
8. Sobald die Arteria carotis communis freigelegt ist, verwenden Sie eine nicht resorbierbare Seidennaht (5/0), um die Halsschlagader zu isolieren, und trennen Sie zuerst die Halsschlagader vom Vagusnerv, indem Sie mit einer feinen Pinzette rückwärts präparieren und darauf achten, dass Sie nicht mit dem Nerv in Berührung kommen. Sobald das Gefäß mit der Naht verschlungen (aber nicht gebunden) wurde, kleben Sie die Enden der Naht mit chirurgischem Klebeband zusammen, um zu verhindern, dass dieser Schritt rückgängig gemacht wird. Entfernen Sie die Nähte, die die darüber liegende Haut zurückhalten.
9. Wiederholen Sie den Vorgang für die andere Seite.
10. Legen Sie eine sterile, mit Kochsalzlösung getränkte Gaze in die Wunde, um das Gewebe für den Rest der Operation feucht zu halten. Vernähen Sie die Haut locker und legen Sie eine zusätzliche, mit Kochsalzlösung getränkte Gaze auf die Stelle, um eine weitere Austrocknung zu verhindern.
11. Setzen Sie Ratten in eine seitliche Position und machen Sie einen Schnitt in der Haut in der Mitte zwischen der rechten Augenhöhle und dem äußeren Gehörgang. Ziehen Sie die Haut mit bis zu fünf elastischen 3-mm-Hakenhaken zurück, die an der Korkplatte befestigt sind, und präparieren Sie dann den Schläfenmuskel, um den Schädel freizulegen.
12. Platzieren Sie einen mit dem Daumenrad abgestimmten, durch Schwerkraft angetriebenen Kochsalztropfen über der offenen Stelle (Flussrate ca. 2 ml/min) und richten Sie ein Aspiratorsystem ein, um Knochentrümmer zu entfernen und kleinere Blutungen von der exponierten Stelle während dieser Phase der Operation zu entfernen.
    1. Platzieren Sie die Kochsalzlösungsdüse am höchsten Punkt des Schädels in der Nähe des Ohrs und die Aspiratordüse am tiefsten Punkt. Stellen Sie das Rad während der Blutung so ein, dass dem Bereich mehr Kochsalzlösung zugeführt wird, um die Ursache einer Blutung für die Kauterisation des Gefäßes besser zu visualisieren und die Zeit zu verkürzen, in der die Tiere unter Narkose stehen.
13. Führen Sie eine Kraniotomie im freiliegenden Bereich (ca. 5 mm x 5 mm) mit einem Zahnbohrer mit einem groben, diamantbeschichteten 1,6-mm-Bohrgrat bei ca. 8.000 U/min durch, wobei sichergestellt wird, dass beim Bohren des freiliegenden Bereichs kreisförmiger und lateraler Druck und kein Abwärtsdruck ausgeübt wird. Sobald der Knochen dünn genug ist, dass er völlig durchsichtig aussieht, entfernen Sie ihn mit einer Pinzette.
14. Verwenden Sie einen selbstgemachten Duralhaken, indem Sie eine Spitze einer feinen Pinzette um etwa 180° biegen, um einen Bogen zu bilden, um die Dura vorsichtig zu öffnen, wobei Sie darauf achten sollten, die großen oberflächlichen Blutgefäße zu vermeiden, da sie empfindlich und leicht zu reißen sind.
    HINWEIS: Der freiliegende Bereich des Gehirns zeigt die mittlere Hirnarterie (MCA); Das gewünschte Segment misst ca. 2 mm in der Länge (siehe Abbildung 1).
15. Koagulieren Sie die MCA von der Stelle, an der sich die Vena cerebralis inferior kreuzt, bis zur Arteriengabelung und dann entlang der kaudalen Äste der MCA mit einer diathermischen Pinzette, bis sie vollständig verschlossen ist. Verwenden Sie eine abgewinkelte Diathermie-Pinzette von Jeweler mit 0,25 mm spitzen Spitzen.
    1. Wenn Sie die Arterie verschließen, ändern Sie den Salzfluss nach Bedarf, um diesen Bereich kühl zu halten und zu verhindern, dass die Gerinnungszange am Blutgefäß haftet. Wenn das Blutgefäß verschlossen ist, erscheint es schwarz und es sollten keine Anzeichen eines Blutflusses vorhanden sein. Der Blutfluss ist in teilweise verschlossenen Gefäßen zu sehen.
    2. Schneiden Sie den MCA an dieser Stelle, um die vollständige Okklusion zu bestätigen. Schneiden Sie mit einer mikrovaskulären Schere unter die Stelle, an der die Vena cerebralis inferior die MCA kreuzt.
    3. Decken Sie die freiliegende Stelle mit einem mit Kochsalzlösung getränkten Mullkissen ab, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren.
16. Drehen Sie die Ratte wieder in Rückenlage und öffnen Sie die lose gebundene Naht am Hals wieder, um die Halsschlagadern wieder freizulegen. Die Halsschlagader wird auf der gleichen Seite wie die verschlossene Halsschlagader (rechts) dauerhaft verzahnt, indem ein Knoten in die Seidennaht um die Halsschlagader gebunden wird, während die linke Halsschlagader mit einem 13 mm starken Arterienclip aus Edelstahl mit 125 g Druck für 60 min vorübergehend verschlossen wird. Nähen Sie während dieser Zeit den Schnitt im Hals locker zu und legen Sie eine sterile, mit Kochsalzlösung getränkte Gaze darauf, um ein Austrocknen zu verhindern.
    1. Beachten Sie, dass sich die rechte Seite des Tieres aufgrund der Rückenlage auf der linken Seite des Chirurgen befindet.

Ergebnisse

Abbildung 1. Chirurgischer Aufbau des permanenten distalen Verschlussmodells der mittleren Hirnarterie. Die Ausrüstung, die bei der Vorbereitung der Rattenkraniotomie verwendet wurde, ist für die rechte Hemisphäre und den Einsatz der Positionierung des Aspirators und den Kochsalztropfen um die Kraniektomiestelle herum dargestellt. Ebenfalls dargestellt sind die wichtigsten Merkmale des Gefäßsystems;...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Carprofen	Norbrook	VM-Nr.: 02000/4229	geben 0,25 mg/kg
Atropinsulfat	AmTech	RXATRINJ-100
Alkoholtupfer	UHS	20021
Lidocain-Creme (Emla)	AstraZeneca	12901	Tragen Sie einen erbsengroßen Tropfen auf den rasierten Hals und die Schläfenregion auf
Homöothermisches Deckensystem	Harvard-Instrumente	507222F
Pinzette	Werkzeuge der Feinforschung	11019-12
Isofluran	Abbott	Nr. B506
Seidennähte	Harvard-Apparat	723288
Kautersystem	Eschmann
0,25 mm Juwelier-Zange	Eschmann	8330349
feine Dumont-Zange	Feine wissenschaftliche Werkzeuge	11251-10
Daumengetriebenes Kochsalz-Tropfsystem
Vacusafe Absaugsystem	INTEGRA BIOWISSENSCHAFTEN	158320
16 mm grobe, diamantbeschichtete Stahlmahlscheiben		K801 104 016
Handgeführter Zahnbohrer	NSK	NSKVMAXVRE (Handstück NSKEX6B)
Vannas Federschere	Feine wissenschaftliche Werkzeuge	15000-03
Mikrovaskuläre Schere	Welt Präzisionsinstrumente	501790
4-0 Vicryl-Nähte	Ethicon
Gefäßclip und Applikator
Operationsmikroskop	Zeiss
Kompaktes Anästhesiesystem Isofluran K/F Einzelgas	VetTech-Lösungen
Skalpellklingen aus Kohlenstoffstahl Nr. 10	Swann-Morton	201
25g Nadeln	Terumo	NN-2525R
Spritzen (1 ml und 5 ml)	Terumo	SS+01T1 / SS*05SE1
Kochsalzlösung (Natriumchlorid 0,9%)	Fresenius Kabi	PL 08828/0178
Wattestäbchen	Johnson und Johnson	5.00021E+12	Vor Gebrauch sterilisieren
Gaze			Vor Gebrauch sterilisieren