Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom örtlichen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
1. Spritze für die Injektion vorbereiten
- Lysolecithin wird in einer 1%igen Lösung in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS; pH 7,4) gelöst und bei -20 °C in kleinen Aliquoten (75 μl) gelagert. Tauen Sie ein Fläschchen auf Raumtemperatur (RT) auf.
HINWEIS: Wenn Lysolecithin ungelöst ist, beschallen Sie das Röhrchen ca. 30 Minuten lang in einem Ultraschallreiniger (40 kHz), um eine gleichmäßige Lösung zu bilden.
- Behandeln Sie die vorgezogene Glaskapillare mit äußerster Sorgfalt, um eine Beschädigung der empfindlichen Spitze zu vermeiden. Schrauben Sie die Mutter einer 10-μl-Injektionsspritze ab und fädeln Sie sie auf das flache Ende der Kapillare, gefolgt von zwei Aderendhülsen, wobei Sie darauf achten, dass die Gegenenden der Aderendhülsen ausgerichtet sind und die Kapillare fest in der konischen Ferrule sitzt (Abbildung 1). Spülen Sie die Spritze mit Isopropylalkohol aus und entfernen Sie den Kolben. Schrauben Sie nach dem Trocknen die Nadeleinheit mit der Hand fest auf die Injektionsspritze.
- Befestigen Sie die Nabennadel aus Metall an der Zündspritze. Durchstechen Sie mit der Nadel eine Gummischeibe und schieben Sie sie bis zur Basis hinunter. Füllen Sie die Priming-Spritze mit Lysolecithin. Drücken Sie die Zündspritze vorsichtig zusammen, bis Flüssigkeit an der Spitze der Nadel sichtbar ist. Dadurch wird sichergestellt, dass keine Luftblasen in die Injektionsspritze gelangen.
- Führen Sie die Metallnabennadel der Injektionsspritze in die Injektionsspritze ein. Mit der Gummischeibe einen festen Verschluss herstellen, drücken Sie die Enthüllungsspritze langsam zusammen, bis die Kapillare die Spitze mit Lösung füllt. Entfernen Sie die Injektionsspritze vorsichtig und drücken Sie sie gleichzeitig, um den Zylinder der Injektionsspritze zu füllen, ohne Luftblasen einzuführen. Führen Sie den Kolben in die Injektionsspritze ein und stellen Sie sicher, dass die Lösung aus der Spitze der Kapillare fließt, während der Kolben leicht gedrückt wird.
HINWEIS: Wenn Luftblasen in der Kapillar- oder Injektionsspritze sichtbar sind, muss die Spritzenvorbereitung von Anfang an wiederholt werden. Eine kontinuierliche Flüssigkeit in der Injektionsvorrichtung ist entscheidend, um genaue Injektionsmengen zu gewährleisten.
- Befestigen Sie die fertige Injektionsspritze am Arm eines stereotaktischen Mikromanipulators. Dieses fertige Gerät wird in der Lage sein, 15-20 Tiere zu injizieren, bevor es nachgefüllt werden muss.
- Entsorgen Sie das restliche Lysolecithin aus der Zündspritze. Ziehen Sie den Isopropylalkohol mehrmals heraus, drücken Sie ihn nieder und nehmen Sie die Metallnabennadel ab. Warten Sie einige Stunden, bis der restliche Isopropylalkohol in der Grundspritze verdampft ist, bevor Sie erneut einfüllen.
2. Bereiten Sie das Tier auf den chirurgischen Eingriff vor
HINWEIS: Dieses Verfahren wird für weibliche C57BL/6-Mäuse im Alter von 8-10 Wochen beschrieben.
- Betäuben Sie das Tier mit einer intraperitonealen Injektion von Ketamin (200 mg/kg) und Xylazin (10 mg/kg) oder gemäß den Vorschriften der institutionellen Tierpflege. Planen Sie, dass das Tier etwa 1 Stunde lang unter Narkose steht, wenn Sie eine injizierbare Anästhesie verwenden.
- Testen Sie, ob das Tier tief betäubt ist, indem Sie den Fuß fest einklemmen. Ein richtig betäubtes Tier wird nicht auf das Kneifen reagieren.
- Rasieren Sie mit einer Schermaschine einen 2-3 cm2 Bereich auf der Rückenseite des Tieres, in der Nähe der Ohren. Achten Sie darauf, die Ohren nicht zu beschädigen.
- Wischen Sie den Bereich mit 70% Ethanol sauber, das auf ein Mullpad aufgetragen wird. Stellen Sie sicher, dass alle abgeschnittenen Haare aus dem Bereich entfernt wurden. Desinfizieren Sie den Bereich mit Jod.
- Tragen Sie Vaseline auf die Augen auf, um ein Austrocknen während des gesamten Eingriffs zu verhindern.
- Halten Sie das Tier in einer beheizten Auffangkammer, bis es bereit ist, mit dem Eingriff zu beginnen.
3. Führen Sie den chirurgischen Eingriff durch
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass alle Schritte des Verfahrens eine angemessene aseptische Technik haben. Dazu gehört die ordnungsgemäße Verwendung von Handschuhen, Haarnetzen, Masken und Vorhängen. Alle Werkzeuge sollten sterilisiert werden, bevor sie mit dem Tier in Berührung kommen.
- Bewegen Sie das Tier mit der Rückenseite nach oben auf einen stereotaktischen Rahmen, der in der Mitte durch gefaltete Papiertücher angehoben wird, um die Krümmung der Wirbelsäule zu übertreiben. Befestigen Sie die Arme und den Schwanz mit chirurgischem Klebeband und sichern Sie den Kopf mit einer Zahnklemme. Stabilisierende Ohrbügel sind für dieses Verfahren nicht notwendig.
- Verwenden Sie ein Skalpell, um einen 3 cm langen Schnitt in der Mittellinie zu machen, der direkt unter den Ohren beginnt und in kaudaler Richtung schneidet.
- Lokalisieren Sie die Trennlinie zwischen den beiden großen Fettstrukturen und ziehen Sie diese mit einer feinen Pinzette in jeder Hand auseinander. Spreizen Sie die Retraktoren, um das Operationsfeld zu öffnen.
- Lokalisieren Sie unter einem Operationsmikroskop den markanten Auswuchsprozess des Brustwirbels 2 (T2) (HINWEIS: Dieses Merkmal ist charakteristisch für den Mausstamm C57BL/6). Führen Sie eine stumpfe Dissektion mit geschlossener Federschere durch die darüber liegende Muskulatur durch, um T2 besser sichtbar zu machen. Fühlen Sie mit der Pinzette nach den harten Oberflächen des Brustwirbels 3 (T3) und des Brustwirbels 4 (T4), um die richtige anatomische Position zu bestätigen.
- Machen Sie mit einer Federschere flache seitliche Schnitte (2-3 mm tief) des Bindegewebes zwischen T3 und T4. Aufgrund des natürlichen Abstands zwischen den Wirbeln im oberen thorakalen Teil der Wirbelsäule der Maus ist eine Laminektomie zur Freilegung des Rückenmarks nicht erforderlich. Seien Sie sich bewusst, dass ein zu tiefer Schnitt die Nabelschnur durchbohrt und beschädigt.
HINWEIS: Ein kleiner Grad von Blutungen ist während dieses Schritts üblich. Halten Sie in diesem Fall einen Schwammspeer in den Bereich, bis die Blutung nachlässt (30-60 Sekunden).
- Visualisieren Sie das Rückenmark. Sie wird mit einer dicken Schicht sichtbarer Dura bedeckt, wenn diese Hirnhautschicht beim Freilegen der Nabelschnur noch nicht durchtrennt wird. Ein hervorstehendes Blutgefäß verläuft kaudal/rostral durch die ungefähre Mittellinie des Rückenmarks.
HINWEIS: Dieses Gefäßsystem sollte nicht als Orientierungspunkt für die Mittellinie verwendet werden. Stattdessen sollte eine angemessene Beleuchtung die Grenzen zwischen grauer und weißer Substanz sichtbar machen, die die dorsale Säule flankieren, was zur Abschätzung der Mittellinie verwendet werden sollte.
- Wenn die Dura intakt bleibt, mit einer 32 G Metallnadel leichte seitliche Kratzer machen, bis sie frei ist. Ziel ist es, die Dura zu entfernen, ohne die verbleibenden darunter liegenden Hirnhäute zu durchtrennen, die nicht so dick und schwerer zu sehen sind.
HINWEIS: Die Freisetzung von Liquor cerebrospinalis deutet auf einen Bruch des Arachnoids hin, und obwohl dies ohne mechanische Schädigung des Gewebes geschehen kann, sollte die angesammelte Liquor cerebrospinalis mit einem Schwammspeer entfernt werden, um die Oberfläche des Rückenmarks besser sichtbar zu machen.
- Bewegen Sie die Injektionsspritze an Ort und Stelle und senken Sie sie langsam ab, bis die Spitze der Kapillare das Rückenmark unmittelbar seitlich der Mittellinie gerade noch berührt. Arretieren Sie den Arm.
- Verwenden Sie die abgestuften Messungen des stereotaktischen Arms in Z-Richtung, um eine Basispositionsmessung durchzuführen. Von diesem Messwert subtrahieren Sie 1,3 mm. Stechen Sie mit einer schnellen und flachen Abwärtsbewegung in das Gewebe und senken Sie die Kapillare vorsichtig ab, bis die neue Messung erreicht ist. Optional: Falls gewünscht, können Läsionen in der dorsalen Säule durch die gleiche Lochbewegung an der Mittellinie und einer Tiefe von 0,3 mm erzeugt werden.
HINWEIS: Diese Werte sind spezifisch für die Injektion zwischen T3 und T4. Wenn Sie sich dafür entscheiden, die Injektion an einer anderen Stelle im Rückenmark durchzuführen, müssen diese Werte aus einem verfügbaren Atlas des Maushirns abgeleitet werden.
- Verwenden Sie den Mikromanipulator, um Lysolecithin in die weiße Substanz des ventralen Rückenmarks zu drücken. Machen Sie eine Umdrehung des Mikromanipulators alle 5 Sekunden für 2 Minuten, was zu einem Endvolumen von 0,5 μl führt. Lassen Sie die Kapillare weitere 2 Minuten an Ort und Stelle, um einen Rückfluss der Lösung zu verhindern, und entfernen Sie dann vorsichtig die Kapillare.
- Binden Sie eine einzelne Naht in das Muskel-/Fettgewebe, das die Wirbelsäule überlagert. Verwenden Sie eine ununterbrochene Naht, um die Haut zu schließen. Tragen Sie mehr Jod auf die Inzisionsstelle auf.
- Setzen Sie das Tier in eine beheizte Auffangkammer, bis es sich erholt hat, und bringen Sie es dann in seinen Käfig zurück. Tragen Sie postoperativ Analgetika gemäß den Vorschriften der institutionellen Tierpflege auf. Eine zusätzliche postoperative Betreuung ist in der Regel nicht erforderlich, da die Tiere vollständig gehfähig sind und in der Lage sind, sich selbst zu füttern und zu trinken, sobald sie sich von der Narkose erholt haben.
- Wiederholen Sie den Vorgang für die übrigen Tiere.
HINWEIS: Mit Geschick kann die Operation in 10-15 Minuten pro Tier abgeschlossen werden, insbesondere mit Hilfe einer zweiten Person, die die Nähte bindet. Die gleiche Glaskapillare kann für etwa 15-20 Operationen verwendet werden, bevor die Spitze stumpf wird und ausgetauscht werden sollte. Kontrolloperationen können identisch wie beschrieben durchgeführt werden, mit einer Injektion von PBS in das Rückenmark anstelle von Lysolecithin. Wir empfehlen, die Kapillaren für die zukünftige Verwendung nicht zu reinigen.
