Induktion einer gezielten neuronalen Schädigung mit einem Hochleistungslaser in einer Drosophila-Larve

Zusammenfassung

Quelle: Li, D., Li, F., et al. Ein Drosophila-In-vivo-Verletzungsmodell zur Untersuchung der Neuroregeneration im peripheren und zentralen Nervensystem. J. Vis. exp. (2018)

Dieses Video zeigt eine Methode zur Induktion einer gezielten neuronalen Schädigung in Drosophila-Larven mit Hilfe eines Hochleistungslasers. Nachdem die Larve unter einem Mikroskop positioniert wurde, sucht ein Laser mit geringer Leistung nach fluoreszierenden Neuronen, und dann wird die Laserleistung erhöht, um lokalisierte Schäden zu induzieren. Die Verletzung wird durch eine erhöhte Fluoreszenz und einen Krater an der Verletzungsstelle bestätigt.

Protokoll

1. Zwei-Photonen-Schädigung und konfokale Bildgebung

1. Aufbau des Mikroskops
   ANMERKUNG: Für dieses Experiment wurde ein konfokales Laser-Scanning-Mikroskop mit einem Zwei-Photonen-Laser verwendet, aber andere Systeme mit einem gleichwertigen Aufbau werden auch ausreichen. Der Zwei-Photonen-Laser (930 nm) wurde für die Verabreichung von Verletzungen und ein Argon-Laser (488 nm) für die konfokale Bildgebung von GFP verwendet.
   1. Schalten Sie zu Beginn jeder Sitzung den Zwei-Photonen-Laser und/oder den/die konfokalen Laser(n) und das Mikroskop ein. Öffnen Sie dann die Imaging-Software.
   2. Für eine Zwei-Photonen-Verletzung stellen Sie die folgenden Parameter für die Abbildung von GFP mit dem Zwei-Photonen-Laser bei 930 nm (1.950 mW) ein.
      1. Wählen Sie den Zeilenscan-Modus. Öffne die Lochblende ganz offen. Erhöhen Sie die Laserintensität auf ~20 % (390 mW).
      2. Wählen Sie 512 x 512 als Frame-Scan aus. Verwenden Sie die maximale Scangeschwindigkeit (in der Regel mit einer Pixelverweilzeit von 0,77 μs). Stellen Sie sicher, dass die durchschnittliche Anzahl 1 und die Bittiefe 8 Bit beträgt.
      3. Stellen Sie die Verstärkung auf ~750 und den Offset auf 0 ein.
      4. Speichern Sie dieses voreingestellte experimentelle Protokoll als 2P GFP 930 Ablation, um eine einfache Wiederverwendung in zukünftigen Experimenten zu ermöglichen.
   3. Für die konfokale Bildgebung stellen Sie die folgenden Parameter für die Abbildung von GFP mit dem Argon-Laser bei 488 nm ein:
      1. Wählen Sie die Registerkarte Erfassung und dann Z-Stack aus.
      2. Schalten Sie unter "Laser" den 488-nm-Argon-Laser ein.
      3. Gehen Sie zu Kanäle, wählen Sie den 488-mm-Laser aus und erhöhen Sie die Laserleistung auf 5-10%. Für die Lochblende verwenden Sie die 1-2 luftige Einheit (AU). Stellen Sie die Verstärkung auf 650 ein.
      4. Wählen Sie in Erfassungsmodus 1024 x 1024 als Frame-Scan aus, verwenden Sie die maximale Scangeschwindigkeit, eine durchschnittliche Anzahl von 2 und eine Bittiefe von 8 Bit.
      5. Speichern Sie dieses voreingestellte experimentelle Protokoll als GFP (grün fluoreszierendes Protein) Imaging.
2. Larvenanästhesie mit Diethylether und Halterung
   1. Stellen Sie eine 60-mm-Glasschale in einen Abzug in eine 15 cm dicke Petrischale aus Kunststoff. Falten Sie ein Stück Seidenpapier und legen Sie es auf den Boden der Glasschale, dann legen Sie eine Traubensaft-Agar-Platte auf das Taschentuch. Gib Diethylether in die Glasschale, bis zu dem Punkt, an dem das Seidenpapier durchnässt ist und eine Schicht aus flüssigem Äther in der Schale zurückbleibt. Halten Sie den Deckel immer auf.
   2. Bereiten Sie einen Objektträger mit einem Tropfen Halogenkohlenwasserstoff-27-Öl in der Mitte vor. Geben Sie 4 Flecken Vakuumfett auf die vier Ecken des Objektträgers, um das Deckglas später zu stützen.
   3. Nehmen Sie mit einer Pinzette eine gereinigte Larve auf und legen Sie sie auf die Agarplatte in der 60-mm-Glasschale. Decken Sie die Glasschale mit dem Deckel ab und warten Sie, bis sich die Larve nicht mehr bewegt. Für PNS-Verletzungen/Bildgebung nehmen Sie die Larve heraus, sobald ihr Schwanz aufhört zu zucken. Warten Sie beim ZNS, bis die gesamte Larve bewegungslos wird, insbesondere die Kopfsegmente.
      HINWEIS: Der Zeitpunkt der Ether-Exposition ist entscheidend. Siehe Diskussion.
   4. Heben Sie die betäubte Larve vorsichtig auf und legen Sie sie mit dem Kopf aufrecht in den Tropfen Halogenkohlenwasserstofföl auf dem Objektträger. Füge ein Deckglas auf die Folie auf. Drücken Sie mit leichtem Druck auf das Deckglas, bis es die Larve berührt (Abbildung 1A).
   5. Passen Sie die Position der Larve an, indem Sie das Deckglas vorsichtig nach links oder rechts schieben, um die Larve zu rollen, so dass das interessierende Neuron/Axon/Dendrit oben und am nächsten an der Mikroskoplinse ist.
   6. Bei PNS-Verletzungen die Larve mit der Rückenseite nach oben montieren, so dass beide Luftröhren sichtbar sind. Rollen Sie dann die Larve ~30 Grad nach links, um Neuronenaxone der Klasse III zu verletzen (Abbildung 1B und 1C), 90 Grad, um Neuronenaxone der Klasse IV zu verletzen (Abbildung 1B und 1E), oder ~30 Grad, um Neuronendendriten der Klasse IV zu verletzen.
   7. Positionieren Sie die Larve bei ZNS-Verletzungen perfekt mit der Bauchseite nach oben, so dass der interessierende Bereich der Mikroskoplinse in der z-Ebene am nächsten ist.
3. Verletzung durch Zwei-Photonen-Laser
   1. Legen Sie den Objektträger mit der Larve unter das Mikroskop und befestigen Sie ihn mit dem Objektträgerhalter auf dem Tisch. Benutze das 10-fache (0,3 NA) Ziel, um die Larve zu finden.
   2. Geben Sie 1 Tropfen Objektivöl auf das Deckglas, wechseln Sie zum 40X (1,3 NA) Objektiv und stellen Sie den Fokus ein.
   3. Wechseln Sie in den Scan-Modus und verwenden Sie das experimentelle Protokoll 2P GFP 930 Ablation. Achte darauf, dass die Lochblende ganz geöffnet ist.
      HINWEIS: Die Konfiguration muss auf der Grundlage einzelner Systeme optimiert werden.
   4. Starten Sie den Live -Modus, um den Bereich of Interest (ROI) zu lokalisieren, und passen Sie die Einstellungen an, um mit dem entsprechenden Zoom eine gute Bildqualität zu erzielen.
      HINWEIS: Der Zweck dieses Schritts besteht darin, das Neuron/Axon/Dendriten zu finden, das verletzt werden soll, anstatt das Bild mit der besten Qualität aufzunehmen. Verwenden Sie daher die minimalen Einstellungen, die ausreichen, um den Zielbereich zu visualisieren, um Überbelichtung oder Photobleaching zu vermeiden.
   5. Stoppen Sie den Live-Scan , sodass die Schaltfläche Zuschneiden verfügbar wird. Lassen Sie das Standbild als Roadmap dienen. Wählen Sie die Funktion Zuschneiden und passen Sie das Scan-Fenster so an, dass es auf das zu verletzende Ziel fokussiert wird.
   6. Reduzieren Sie den ROI auf die Größe der potenziellen Verletzungsstelle. Decken Sie zum Beispiel einfach die Breite eines Axons oder eines Dendriten ab, um die Präzision der Verletzung zu gewährleisten und die Schädigung benachbarter Gewebe zu reduzieren. Falls gewünscht, können Sie den ROI vor dem Zuschneiden vergrößern, um präzisere Verletzungen zu ermöglichen.
   7. Öffnen Sie ein neues Imaging-Fenster. Reduzieren Sie die Scangeschwindigkeit und erhöhen Sie die Laserintensität. Bestimmen Sie die Erhöhung der Laserintensität basierend auf dem Gewebefluoreszenzsignal, das im Live -Modus gescannt wird.
   8. Stellen Sie in der Regel die Zwei-Photonen-Laserintensität ab 25 % für PNS-Verletzungen und 50-100 % für VNC-Verletzungen ein. Bei PNS-Axonverletzungen ist darauf zu achten, dass die Laserintensität ~480 mW und die Pixelverweilzeit 8,19 μs beträgt. Stellen Sie bei der Verletzung des VNC-Axons sicher, dass die Laserintensität und die Pixelverweilzeit in der Regel 965-1930 mW bzw. 8,19-32,77 μs betragen.
   9. Starten Sie Kontinuierlicher Scan. Lassen Sie den Cursor über die Schaltfläche Kontinuierlich bewegen. Behalten Sie das Bild genau im Auge und stoppen Sie den Scan, sobald ein drastischer Anstieg der Fluoreszenz beobachtet wird.
      HINWEIS: Das Auftreten der Fluoreszenzspitze ist auf die Autofluoreszenz an der Verletzungsstelle zurückzuführen.
   10. Wechseln Sie zurück in den Live-Modus, indem Sie die Einstellungen wiederverwenden. Finden Sie den interessierenden Bereich, der gerade angesprochen wurde, indem Sie den Fokus anpassen.
       HINWEIS: Ein guter Hinweis auf eine erfolgreiche Verletzung ist das Auftreten eines kleinen Kraters, einer ringförmigen Struktur oder lokalisierter Trümmer direkt an der Verletzungsstelle.
   11. Wechseln Sie zum nächsten Neuron und wiederholen Sie den Vorgang ab Schritt 1.3.5, um mehrere Neuronen in einem einzigen Tier zu verletzen. Oder wiederholen Sie Schritt 3.3.5, während Sie die Leistung schrittweise erhöhen und/oder die Scangeschwindigkeit verringern, wenn die ursprüngliche Verletzung nicht ausreichte.
       HINWEIS: Für den Fall, dass die Laserleistung zu hoch ist, wird ein großer beschädigter Bereich auf dem Live-Scan-Bild nach der Verletzung sichtbar sein. Zu starke Verletzungen können zum Tod der Larve führen.
   12. Erholen Sie die Larve, indem Sie das Deckglas vorsichtig entfernen und die verletzte Larve auf eine neue Platte mit Hefepaste setzen. Graben Sie mehrere Höhlen auf der Agarplatte mit einer Pinzette; Alternativ können Sie eine Insel Agar in die Platte legen, anstatt die ganze Platte zu verwenden, um die Möglichkeit zu verringern, dass die Larve aus der Platte kriecht.
   13. Die Platte in eine 60-mm-Petrischale mit feuchtem Tuch (getränkt mit 0,5%iger Propionsäurelösung) legen und bei Raumtemperatur oder 25 °C kultivieren.
       HINWEIS: Die Larve verbleibt bei Raumtemperatur (22°C) im Vergleich zu 25°C etwa einen Tag länger im Larvenstadium.

Ergebnisse

Abbildung 1: Die Regeneration von Neuronenaxonen in der Peripherie zeigt Klassenspezifität. (A und B) Schematische Zeichnung, die die Position der Larven zeigt. (C) Schematische Zeichnung von Neuronen der Klasse III da. (D) Axone der Klasse-III-da-Neuronen ddaF, markiert mit 19-12-Gal4, UAS-CD4-tdGFP, repo-Gal80/+, wachsen nicht nach. (E) Schematische Zeichnung von Neuronen der Klasse IV da. (F) Ax...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Diethylether, ACS-Reagenz, wasserfrei	Acros Organics	AC615080010
Halogenkohlenwasserstoff 27 Öl	Genesee Wissenschaftlich	59-133
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), 20x Konzentrat, pH 7,5, Lieferant # E703-1L	VWR	97062-948
Agar Pulver, Alfa Aesar, 500GM	VWR	AAA10752-36
Traubensaft	Welch's
Ethanol 95% (Reagenz Alkohol 95%)	VWR	64-17-5
Essigsäure	Sigma-Aldrich	A6283
Propionsäure	J.T.Bäcker	U33007
Deckgläser: Rechtecke	Fischer Wissenschaftlich	12-544-D	50 mm x 22 mm
Zeiss LSM 880 Laser-Scanning-Mikroskop	Zeiss
Zen-Software	Zeiss
Chamäleon Ultra II	Kohärent