1. Vorbereitung von Medien und Reagenzien
- Tauen Sie die Basalmembran-Matrix-Beschichtung für Kulturplatten bei 4 °C auf (lassen Sie die Basalmembran-Matrix nicht erwärmen, da sie sich sonst verfestigt). Stellen Sie 1 ml Aliquots her und lagern Sie sie bei -20 °C oder -70 °C.
- Rekonstituieren Sie den basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF) in steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) bei 10 μg/ml und stellen Sie 10 μl Aliquote her. Bei 4 °C lagern.
- Zu einer neuen, ungeöffneten 500-ml-Flasche DMEM/F12 mit Glutamin fügen Sie B27 (10 ml), N2 (5 mL) und Penicillin-Streptomycin (5 mL) hinzu. Geben Sie 50 ml dieses Mediums für neurale Stammzellen (NSC) in ein konisches Röhrchen und fügen Sie 10 μl 10 μg/μl (2 μg/ml endgültig) bFGF hinzu. Lagern Sie den NSC (+) bFGF-Datenträger bei 4 °C.
- Um (-) bFGF-Medien herzustellen, verwenden Sie das gleiche Rezept wie in Schritt 1.3 beschrieben, fügen Sie jedoch kein bFGF hinzu. Dieses Medium wird verwendet, um NSCs zu Neuronen zu differenzieren und neuronale Kulturen nach der Differenzierung zu erhalten.
2. Lentivirale Konstrukte
HINWEIS: Bevor Sie mit der Arbeit mit lentiviralen Konstrukten beginnen, stellen Sie sicher, dass das Labor für die Verwendung von Mitteln der Biosicherheitsstufe 2 (BSL-2) zugelassen wurde. Darüber hinaus müssen bei der Arbeit mit lentiviralen Vektoren BSL-2-Kulturhauben, persönliche Schutzausrüstung (PSA) und Entsorgungsmethoden verwendet werden.
- Beziehen Sie Tau-Konstrukte, die in Lentiviren verpackt sind, aus einer bevorzugten Quelle.
3. Kultivierung menschlicher neuraler Stammzellen
HINWEIS: NSCs werden in der Regel mit 100.000–150.000 Zellen/cm2 gesät, und die meisten im Handel erhältlichen NSCs werden als 1 x 106 Zellen/Fläschchen verkauft. Dieses Protokoll wurde für 10-cm-Zellkulturschalen optimiert (obwohl auch andere Schalengrößen verwendet werden können); Wenn kommerziell erhältliche NSCs verwendet werden, müssen die NSCs daher möglicherweise expandiert werden, indem sie zuerst in Sechs-Well-Schalen kultiviert werden, um genügend Zellen für die Aussaat von 10-cm-Schalen zu erhalten. Dieses Protokoll kann alternativ für eine Vielzahl von Zellkulturschalengrößen angepasst werden.
- Für die Vorbereitung von Zellkulturplatten wird ein Aliquot der gefrorenen Basalmembran-Matrixbeschichtung für Zellkulturplatten entfernt und bei 4 °C auftauen gelassen (Aliquote können am Tag vor der Aussaat der Zellen über Nacht bei 4 °C gelagert werden). Geben Sie 385 μl Basalmembran-Matrix-Beschichtung zu 5 ml DMEM/F12-Medium + Penicillin-Streptomycin.
HINWEIS: 5 ml DMEM/F12-Medium + Penicillin-Streptomycin reichen aus, um eine einzelne 10-cm-Schale zu beschichten (1 ml dieser Basalmembran-Matrix-Beschichtungslösung reicht aus, um eine Vertiefung einer Sechs-Well-Schale zu beschichten). Alternativ, wenn die Zellen fixiert und immungefärbt oder auf Thioflavin gefärbt werden sollen, kultivieren Sie Zellen auf Glasdeckgläsern in 24-Well-Kulturschalen.
- Halten Sie das Medium und die Matrixbeschichtung kalt, bevor und während der Zugabe zu Kulturschalen. Geben Sie die Basalmembran-Matrix-Beschichtung auf die Kulturschalen und stellen Sie die Schalen für 1 h in einen Inkubator (bei 37 °C). Für eine optimale Beschichtung inkubieren Sie die Basalmembranmatrix nicht länger als oder weniger als 1 h. Nach 1 h aspirieren Sie die Basalmembran-Matrix-Beschichtung aus den Zellkulturschalen. Stellen Sie sicher, dass dies mit dem Zeitpunkt zusammenfällt, an dem die NSCs für die Beschichtung bereit sind.
HINWEIS: Wenn Zellen aus gefrorenen Beständen nicht aufgetaut werden, überspringen Sie Schritt 3.2 und fahren Sie mit Schritt 3.3 fort.
- Wenn Zellen aus gefrorenen NSC-Beständen aufgetaut werden, nehmen Sie ein Fläschchen mit gefrorenen Zellen und erwärmen Sie es in einem auf 37 °C erhitzten Wasserbad, indem Sie das Fläschchen im Wasser hin und her bewegen. Besprühen Sie das Fläschchen nach dem Auftauen mit 70 % Ethanol und legen Sie es in eine Zellkulturhaube. Übertragen Sie die Zellen auf ~10 mL DMEM/F12 + Penicillin-Streptomycin-Medium und zentrifugieren Sie das Röhrchen bei Raumtemperatur bei 1.000 x g für 5 min. Aspirieren Sie das Medium und resuspendieren Sie die Zellen in NSC-Medien.
- Verdünnen Sie die Zellen in NSC-Medien, um die geeignete Aussaatdichte für das verwendete Zellkulturgefäß zu erhalten.
HINWEIS: Wenn beispielsweise NSCs auf eine Sechs-Well-Platte plattiert werden – eine Well auf einer Sechs-Well-Kulturschale hat eine Oberfläche von 9 cm2 – werden 900.000 bis 1.350.000 Zellen zum Aussäen benötigt. So kann ein Fläschchen mit 1.000.000 Zellen in 2 ml Medium resuspendiert und in eine einzelne Vertiefung einer Sechs-Well-Schale gegeben werden.
- Fügen Sie genügend in NSC-Medien suspendierte Zellen hinzu, um die mit Basalmembranmatrix beschichteten Kulturschalen auszusäen (100.000 Zellen/cm2) und wechseln Sie das Medium jeden zweiten Tag (wenn Sie eine gefrorene Brühe verwenden, wechseln Sie das Medium am Tag nach dem Plattieren und danach jeden zweiten Tag). Züchten Sie die Zellen, bis sie zu 75 % bis 80 % zusammenfließen.
HINWEIS: Die Zellen werden wahrscheinlich kurz nach dem Plattieren eine Konfluenz von 75 % bis 80 % erreichen, aber dies kann länger dauern, wenn gefrorene Bestände verwendet werden.
- Sobald die NSCs zu 75 % bis 80 % konfluent sind, beginnen Sie mit der neuronalen Differenzierung, indem Sie das NSC (+) bFGF-Medium entfernen und durch NSC (-) bFGF-Medien ersetzen. Kultivieren Sie die Zellen in diesem Medium (ersetzen Sie das Medium jeden zweiten Tag) für mindestens 4 Wochen.
HINWEIS: Die Zellen teilen sich nach dem Entzug von bFGF noch einige Tage lang; Daher können die Zellen eine Konfluenz von 90–100 % erreichen.
- Nach 4-wöchiger Kultivierung haben die Zellen ein neuronales Schicksal erreicht und sind bereit für die Behandlung des Lentivirus.
4. Transduktion und Aufrechterhaltung neuronaler Kulturen
- Um Neuronen mit Lentiviren zu transduzieren, verwenden Sie eine Titerzahl von 3,4 x 105 transduzierbaren Einheiten/Zelle (eine 100% konfluente 10-cm-Schale enthält ~10 Millionen Neuronen). Verdünnen Sie die transduzierbaren Einheiten auf die erforderliche Konzentration in Zellkulturmedien und geben Sie sie zu den Zellen (verwenden Sie das normale Medienvolumen für die Zellkulturschale). Zwei Tage nach der Zugabe des Lentivirus waschen Sie die Zellen 1x mit frischen (-) bFGF-Medien (ohne Lentivirus) und kultivieren Sie wie gewohnt in (-) bFGF-Medien.
- Für die postlentivirale Behandlung füttern Sie die transduzierten Neuronen, indem Sie die Zellkulturmedien ([-] bFGF-Medien) jeden zweiten Tag wechseln. Bewahren Sie die Zellen für ~8 Wochen nach der Transduktion auf. Visualisieren Sie die Zellen routinemäßig unter einem Lichtmikroskop, um die Lebensfähigkeit sicherzustellen.
HINWEIS: Spärlichkeit oder dendritische Brüche sind Anzeichen dafür, dass die Zellen nicht mehr lebensfähig sind.
