Alle Verfahren, bei denen Tiermodelle zum Einsatz kommen, wurden vom örtlichen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss der JoVE überprüft.
1. Vorbereitungen
- Modifizieren Sie einen peripheren Venenkatheter mit 16 G für die Intubation. Zur Modifikation kürzen Sie die Nadel um 1 cm und biegen Sie die restlichen distalen 1 cm um 30° in Richtung Injektionsventil. Entfernen Sie die Katheterflügel (Mehrfachverwendung).
- Um eine Hirndruck- oder ICP-Sonde herzustellen, schneiden Sie ein 20 mm langes Stück Polyethylenschlauch (Innendurchmesser (ID): 0,58 mm, Außendurchmesser (OD): 0,96 mm) und brennen Sie ein Ende zu einer kreisförmigen Platte, wobei ein Lumen offen bleibt. Umgehen Sie den Polyethylenschlauch mit 1 mm Silikonschlauch (ID: 1,0 mm, AD: 3,0 mm), bevor Sie 10 mm Silikonschlauch (ID: 0,76 mm, AD: 2,4 mm) mit dem Ende des Polyethylenschlauchs verbinden.
- Schalten Sie den Laptop ein und öffnen Sie die Datenerfassungssoftware. Kalibrieren Sie die Blutdruck- (BP) und intrazerebralen Druckwandler (ICP) sowie den Laser-Doppler gemäß den Anweisungen des Herstellers.
- Bereiten Sie das Blutgasanalysatorgerät vor.
VORSICHT: Stellen Sie sicher, dass genügend Isofluran im Verdampfer vorhanden ist.
- Schalten Sie den O2 und den atmosphärischen Luftstrom ein. Stellen Sie den Durchfluss von O2 auf 30 % und die atmosphärische Luft auf 70 % ein.
- Stellen Sie das Heizkissen auf und stellen Sie die Temperatur auf 37 °C ein.
2. Anästhesie
- Setzen Sie die Ratte in die Anästhesiekammer mit einem Durchfluss von 30 % O2 und 70 % atmosphärischer Luft. 5 % Isoflurangas in die Kammer verabreichen. Eine angemessene Anästhesie dauert ca. 4 Minuten. Kontrolliere die Atmung sorgfältig.
- Wenn die Ratte betäubt ist, legen Sie sie in Rückenlage auf eine schwere Platte, die von einem Gummiband umgangen wird. Platzieren Sie die Vorderzähne der Ratte unterhalb des Gummibandes.
- Ziehe die Zunge vorsichtig mit einer gebogenen Pinzette heraus. Den Kehlkopf mit einer Wattespitze reinigen. Platzieren Sie ein externes Licht in der Mittellinie der Kehle, um die Stimmbänder sichtbar zu machen.
- Intubieren Sie während der Inspiration mit dem modifizierten peripheren Venenkatheter 16 G. Wenn es richtig eingesetzt ist, entfernen Sie das Stiletto. Schließen Sie den Katheter an das Beatmungsgerät an.
HINWEIS: Die korrekte Platzierung des Schlauchs wird durch Brustbewegungen im Takt der Atemfrequenz bestätigt. Wenn Bewegungen des Abdomens zu sehen sind, extubieren Sie die Ratte und führen Sie sie wieder in die Anästhesieglocke ein. Wiederholen Sie den Vorgang nicht mehr als dreimal, da die Gefahr besteht, dass die Atemwege beschädigt werden.
- Nach der Intubation ist das Tier künstlich mit 30 % O2 und 70 % atmosphärischer Luft zu beatmen. Halten Sie die Anästhesie bei 1,5 % bis 3 % Isofluran. Passen Sie das Isofluran an, um den Blutdruck zwischen 80-100 mmHg zu halten.
- Halten Sie das Inspirationsvolumen der Atemschutzmaske bei 3 mL und die Frequenz bei 40-45 Inspirationen/min. Passen Sie das Inspirationsvolumen entsprechend der Blutgasanalyse an.
- Machen Sie mit einer 2-0-Naht einen Stich durch das innere Weichgewebe der Wange. Binden Sie die Naht um den Injektionsschlauch und das Injektionsventil des peripheren Venenkatheters, um den Katheter zu befestigen.
- Bringen Sie die Ratte zum Operationsfeld und legen Sie sie in Rückenlage, wobei der Schwanz zum Chirurgen zeigt.
- Tragen Sie das Augengel bei Bedarf auf, um trockenen Augen entgegenzuwirken.
- Führen Sie eine Zehenkneifung durch, um eine ausreichende Anästhesietiefe zu bestätigen. Beurteilung und Aufrechterhaltung der Anästhesietiefe während der Operation.
3. Katheter für Schwanz
- Desinfizieren Sie die proximalen 3-4 cm des Schwanzes mit 0,5 % Chlorhexidinethanol.
HINWEIS: Von nun an können Sie das Operationsmikroskop nach eigenem Ermessen verwenden.
- Machen Sie einen 15-20 mm großen Hautschnitt am proximalen Ende des Schwanzes auf der ventralen Seite. Achten Sie darauf, die Arterie nicht einzuschneiden.
- Lösen Sie die Haut mit einer gebogenen Pinzette vom darunterliegenden Bindegewebe.
- Dringen Sie vorsichtig in die Faszie ein und legen Sie die Arterie frei.
- Lösen Sie die Schwanzarterie vorsichtig mit einer gebogenen Pinzette aus dem darunter liegenden Gewebe.
- Schieben Sie drei schwarze Seidenfäden unter das Gefäß. Legen Sie einen Faden so weit wie möglich in die Ferne und binden Sie einen chirurgischen Knoten fest um die Arterie. Halten Sie die losen Enden des Fadens mit einem Hämostaten fest.
- Binden Sie die beiden restlichen Fäden locker um die Arterie.
- Schieben Sie den proximalen Faden so proximal wie möglich hinein. Tragen Sie ein Blutstillungsmittel auf, um die Enden des proximalen Fadens zu halten. Ziehen Sie am Blutstillstand leicht, aber genug, um den Blutfluss einzuschränken und zu blockieren. Platzieren Sie das Blutstillbad auf dem Bauch.
- Schneiden Sie die Spitze des Katheters in einem Winkel von 45° ab. Schneiden Sie die scharfe Spitze, um ein Eindringen in die Arterienwand zu verhindern.
- Machen Sie mit einer Vannas-Schere einen Arterienschnitt von 1/3 des Arteriendurchmessers in einem Winkel von 30°, 3-5 mm vom distalen Knoten entfernt.
- Führen Sie den Katheter mit zwei geraden Pinzetten in die Arterie ein. Verwenden Sie eine Pinzette, um den Katheter zu halten, und die andere, um die Arterie vorsichtig über den Katheter zu ziehen.
- Führen Sie den Katheter durch das Gefäß bis zum proximalen Knoten ein und lösen Sie den Knoten vom Hämostaten. Visualisieren Sie den Blutfluss im Katheter. Befestigen Sie den Mittelfaden locker am Katheter.
- Fahren Sie mit dem Einführen bis zu dem Punkt fort, an dem die Arterie wieder von Faszien bedeckt ist, und wenn möglich sogar bis zu dem Punkt, an dem die Arterie wieder von Faszien bedeckt ist.
- Kontrollieren Sie die Katheterplatzierung und ein mögliches Leck durch Spülen mit Kochsalzlösung.
- Befestigen Sie die beiden proximalen Fäden mit chirurgischen Knoten.
HINWEIS: Die Blutdruckmessung muss pulsativ sein; Ist dies nicht der Fall, ist der Katheter nicht richtig platziert.
- Befestigen Sie den Katheter am Ende des Schnitts, indem Sie mit dem distalen Faden einen chirurgischen Knoten binden.
- Nähen Sie den Hautschnitt locker mit zwei nicht resorbierbaren monofilen 4-0-Nähten zusammen. Achten Sie darauf, dass Sie nicht in den Katheter eindringen.
HINWEIS: Achten Sie während der gesamten Operation auf die Amplitude der Pulsation. Wenn dieser niedrig ist, spülen Sie den Katheter mit Kochsalzlösung.
- Lösen Sie den arteriellen Katheter vom Druckwandler, um den Blutfluss für die Blutgasentnahme zu ermöglichen. Legen Sie einen Mikrokapillarschlauch an das Ende des Katheters. Lassen Sie das Blut in den Schlauch fließen. Befestigen Sie den Katheter nach der Blutentnahme wieder am Schallkopf und spülen Sie den Katheter.
- Führen Sie das Kapillarrohr in den Blutgasanalysator ein. Messen Sie den pH-Wert, pCO2 und pO2 und notieren Sie sie
HINWEIS: Abhängig von den Blutgas- und Blutdruckwerten ändern Sie die Beatmungsrate. Wenn der mittlere arterielle Druck (MAP) zu niedrig ist, versuchen Sie, die Flussrate von Isofluran zu verringern. Testen Sie die Reflexe, um die richtige Anästhesietiefe sicherzustellen.
4. ICP-Sonde
- Platzieren Sie die Ratte in den stereotaktischen Rahmen. Es ist wichtig, die Ratte symmetrisch zu positionieren.
- Legen Sie ein zylindrisches Kissen unter den stereotaktischen Rahmen, um eine vordere Beugung des Nackens zu erzeugen.
- Rasieren Sie die Kopfhaut, den Hals und den Bereich hinter den Ohren der Ratte. Entfernen Sie die überflüssigen Haare.
- Desinfizieren Sie den Bereich mit 0,5 % Chlorhexidinethanol.
- Lokal mit 0,7 mL 10 mg/5 μg/mL Lidocain mit Adrenalin anästhesieren, die Nadel am kaudalen Ende des Schädels in der Mittellinie einführen. Mit 0,3-0,4 ml in die Halsmuskulatur injizieren. Injizieren Sie den Rest subkutan um und vor dem Bregma.
- Machen Sie einen Hautschnitt von der Nadel und stechen Sie ~8 mm kaudal in die Mittellinie.
- Präparieren Sie alle Muskeln stumpf in Schichten, um die Atlantokozipitalmembran zu identifizieren (marmorfarbenes Dreieck kaudal zum Schädel in der Mittellinie).
- Verwenden Sie den Alm Retraktor, um die Nackenmuskulatur zu straffen. Platzieren Sie den Zinkenaufroller bei Bedarf kaudal.
- Prüfen Sie, ob die sterile ICP-Sonde an den ICP-Schallkopf angeschlossen ist. Spülen Sie die ICP-Sonde mit Kochsalzlösung. Stellen Sie sicher, dass sich keine Luftblasen in der ICP-Sonde befinden.
- Die Atlantocopcipitalmembran mit einer 23 G Nadel einschneiden. Machen Sie ein Loch, um die ICP-Sonde durch die Membran zu locken.
- Führen Sie die Sonde vorsichtig durch die Atlantokocipitalmembran. Ziehen Sie leicht an der Sonde und stellen Sie sicher, dass sie eine pulsierende Kurve zwischen 0 und 5 mmHg zeigt. Wenn nicht, entfernen Sie die Sonde, überprüfen Sie die Verbindung zum Wandler und bestätigen Sie den Durchfluss durch das Lumen.
- Tragen Sie zwei Tropfen des Gewebeklebers auf. Schieben Sie den 1 mm Silikonschlauch nach vorne zur Membran und tragen Sie zusätzlichen Kleber auf, um das Risiko einer Verschiebung der ICP-Sonde zu minimieren.
- Entfernen Sie den/die Aufrollkorder.
- Machen Sie eine horizontale Matratzennaht am Kopfende des Schnitts und eine einfache unterbrochene Naht am kaudalen Ende mit einer nicht resorbierbaren monofilen 4-0-Naht.
5. Platzierung der Nadel und der Laser-Doppler-Sonde
- Machen Sie einen Schnitt in der Mittellinie direkt vor den Augen, 15 mm kaudal.
- Entfernen Sie das Bindegewebe und die Muskeln mit einer Pinzette. Verwenden Sie das Ende eines sterilen Wattestäbchens als Rougine, um das Bregma und die koronalen Nähte zu identifizieren.
- Setzen Sie den Alm-Retraktor ein.
- Platzieren Sie eine 25 G Spinalnadel in den stereotaktischen Rahmen. Setze die Nadel genau auf das Bregma und notiere dir die Position.
HINWEIS: Platzieren Sie das Mittelliniengelenk des stereotaktischen Rahmens in einem Winkel von 30° zum Tier in der vertikalen Ebene.
- Entfernen Sie die Nadel aus dem Bregma, bewegen Sie den Rahmen 65 mm nach vorne und setzen Sie dann die Nadel in der Mittellinie wieder ein, um die Bohrstelle zu markieren.
- Bohren, bis die Dura mater unterhalb des Knochens identifiziert ist. Entfernen Sie die Knochenfragmente vorsichtig mit einer geraden Pinzette und füllen Sie den Hohlraum mit Knochenwachs.
- Bohren Sie ein weiteres Loch 3-4 mm lateral rechts vom Bregma und knapp vor der Kronennaht für den Laser-Doppler. Es ist nicht notwendig, den Knochen vollständig zu durchbohren. Achten Sie darauf, dass Sie nicht in die Dura mater eindringen.
- Suchen Sie nach den Gefäßen, in denen der Laser-Doppler den Blutfluss messen kann. Platzieren Sie den Laser-Doppler und überprüfen Sie die Werte. Es wird ein Mindestwert von 100 FU benötigt. Entfernen Sie das Mikroskop (künstliches Licht).
- Wenn die Werte noch akzeptabel sind, fügen Sie einen Tropfen Kleber hinzu, um die Sonde zu fixieren.
- Überprüfen Sie erneut, ob der Wert über 80 FU liegt. Wenn der Wert unter 80 FU liegt, entfernen Sie die Sonde und positionieren Sie sie neu, um einen Wert über 80 FU zu erreichen.
HINWEIS: Der Wert FU ist eine willkürliche Einheit, die den zerebralen Blutfluss (CBF) anzeigt.
6. Induktion einer Subarachnoidalblutung (SAB)
- Führen Sie die Nadel vorsichtig durch den Schädel in der Mittellinie zwischen den Hemisphären ein, bis der Widerstand der Schädelbasis spürbar ist. Ziehen Sie die Nadel um 1 mm zurück, um die korrekte Platzierung direkt vor dem Chiasma opticum zu gewährleisten.
- Drehen Sie die Nadel um 90° im Uhrzeigersinn, so dass die Nadelspitze nach rechts zeigt, um ein möglichst homogenes Ergebnis bei der Blutinjektion zu gewährleisten. Entfernen Sie den Stiletto (Abbildung 1).
- Äquilibrieren Sie für 15 Minuten und passen Sie den Anästhesiegrad an, um einen mittleren arteriellen Blutdruck im Bereich von 80-100 mmHg zu erhalten.
- Führen Sie eine Blutgasanalyse durch. Passen Sie die Anästhesiestärke entsprechend an.
- Entnehmen Sie 500 μl Blut aus dem Schwanzkatheter mit einer 1-ml-Spritze und einer stumpfen 23-G-Nadel.
- Füllen Sie den Totraum der Spinalnadelkammer mit Blut, um eine Injektion von Luft zu vermeiden. Nehmen Sie die 23-G-Nadel aus der blutgefüllten Spritze und vergewissern Sie sich, dass die Spritze 300 μl Blut enthält.
- Verbinden Sie die Spritze mit der Spinalnadel. Fassen Sie das Blut fest und injizieren Sie es manuell, um MAP zu übertreffen.
- Beobachten Sie einen steilen Anstieg des ICP und einen starken Rückgang des CBF auf dem Laptop.
HINWEIS: CBF sollte mindestens 5 Minuten lang 50 % oder weniger im Vergleich zum Ausgangswert betragen, damit die Operation erfolgreich ist, siehe Abbildung 2. Scheinratten durchlaufen die Schritte 6.1-6.7 nicht, wodurch das Einführen der Spinalnadel in das Großhirn vermieden wird, wodurch mögliche spontane Blutungen und iatrogene Hirnschäden minimiert werden.
