Messung mehrerer mitochondrialer Parameter in Neuronen mittels Durchflusszytometrie

Abstract

Quelle: Liang, K. X., et al. Durchflusszytometrische Analyse mehrerer mitochondrialer Parameter in humanen induzierten pluripotenten Stammzellen und ihren neuralen und glialen Derivaten. J. Vis. exp. (2021)

Dieses Video zeigt die Markierung neuronaler Zellen mit Antikörpern für mitochondriale Atmungskettenkomplexe, mitochondriale DNA-assoziierte Proteine und mitochondriale äußere Membranproteine, gefolgt von einer Durchflusszytometrie zur Quantifizierung ihrer Spiegel.

Protocol

1. Durchflusszytometrische Messung von Untereinheiten des MRC-Komplexes (mitochondriale Atmungskette) und TFAM (mitochondrialer Transkriptionsfaktor A) in fixierten Zellen

1. Am Ende der Kulturperiode lösen Sie die Zellen (~10⁶), indem Sie das Zelldissoziationsreagenz hinzufügen; Pelletieren Sie dann und sammeln Sie die Zellen in einem 15-ml-Röhrchen. Waschen Sie die Zellen durch Zentrifugation mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) (1x) zweimal, indem Sie 5 Minuten lang bei 300 × g zentrifugieren.
2. Fixieren Sie die Zellen 10 Minuten lang in 1,6 % Paraformaldehyd (PFA) (1 mL 1,6 % PFA in einem 15 mL Röhrchen) bei Raumtemperatur (RT). Waschen Sie die Zellen durch Zentrifugation mit PBS (1x) zweimal, indem Sie bei 300 × g für 5 min zentrifugieren.
3. Permeabilisieren Sie die Zellen mit eiskaltem 90%igem Methanol (1 mL 90%iges Methanol in einem 15 mL Röhrchen) bei -20 °C für 20 min.
4. Blockieren Sie die Proben in einem Blockierungspuffer mit 0,3 M Glycin, 5 % Ziegenserum und 1 % Rinderserumalbumin (BSA) - Fraktion V in PBS (1x) (1 ml Blockierungspuffer in einem 15 ml-Röhrchen). Waschen Sie die Zellen zweimal durch Zentrifugation mit PBS (1x).
5. Inkubieren Sie die Zellen 30 Minuten lang mit den folgenden Primärantikörpern: Anti-NDUFB10 (1:1.000) zur Messung der Komplex-I-Untereinheit, Anti-Succinat-Dehydrogenase-Komplex-Flavoprotein-Untereinheit A (SDHA, 1:1.000) zur Messung der Komplex-II-Untereinheit und Anti-COX IV (1:1.000) zur Messung der komplexen IV-Untereinheit und Anti-TFAM-Antikörper (mitochondrialer Transkriptionsfaktor A), konjugiert mit Alexa Fluor 488 (1:400). Färben Sie die gleiche Anzahl von Zellen separat mit einem Anti-TOMM20-Antikörper (Translokase der äußeren Mitochondrienmembran 20), der mit Alexa Fluor 488 (1:400) konjugiert ist, für 30 min (1 mL Primärantikörperlösung in einem 15 ml-Röhrchen; Einzelheiten zu den Antikörpern finden Sie in der Materialtabelle ).
6. Waschen Sie die Zellen mit PBS (1x) einmal mit Zentrifugation bei 300 × g für 5 min. Geben Sie den Sekundärantikörper (1:400) in Röhrchen mit NDUFB10, SDHA und COX IV und inkubieren Sie die Zellen 30 Minuten lang mit diesen Lösungen.
7. Waschen Sie die Zellen einmal mit PBS (1x), indem Sie bei 300 × g für 5 min zentrifugieren. Die Überstände werden aspiriert, wobei ca. 100 μl in den Röhrchen verbleiben. Resuspendieren Sie die Zellpellets in 300 μl PBS (1x). Übertragen Sie die Zellen in 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen, die im Dunkeln auf Eis aufbewahrt werden.
8. Analysieren Sie die Zellen auf dem Durchflusszytometer (mit einer Konfiguration mit 3 blauen und 1 roten Lasern). Erkennen Sie Signale in Filter 1 (FL1) mit einem 530/30-Bandpassfilter.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-TFAM, konjugiert mit Alexa Fluor 488	Abcam	ab198308	Primärer Antikörper; Verwendung als 1:400, 2,5 μl in 1000 μl Färbelösung; Verwenden Sie das monoklonale IgG2b Alexa Fluor® 488 der Maus als Isotypsteuerung.
Anti-TOMM20 konjugiert mit Alexa Fluor 488	Santa Cruz Biotechnologie	Kat# sc-17764 RRID:AB_628381	Primärer Antikörper; Verwendung als 1:400, 2,5 μl in 1000 μl Färbelösung; Verwenden Sie das monoklonale IgG2a Alexa Fluor® 488 der Maus als Isotypsteuerung.
Anti-NDUFB10	Abcam	ab196019	Primärer Antikörper; Verwendung als 1:1000, 1 μL in 1000 μl Färbelösung; Alexa Fluor ® 488 Anti-Kaninchen-IgG (1:400, Thermo Fisher Scientific, Katalog # A-11008) als Sekundärantikörper verwenden; monoklonales Kaninchen-IgG als Isotypkontrolle verwenden.
Anti-SDHA	Abcam	ab137040	Primärer Antikörper; Verwendung als 1:1000, 1 μL in 1000 μl Färbelösung; Alexa Fluor ® 488 Anti-Kaninchen-IgG (1:400, Thermo Fisher Scientific, Katalog # A-11008) als Sekundärantikörper verwenden; monoklonales Kaninchen-IgG als Isotypkontrolle verwenden.
Anti-COX IV	Abcam	ab14744, RRID:AB_301443	Primärer Antikörper; Verwendung als 1:1000, 1 μL in 1000 μl Färbelösung; verwenden Sie Alexa Fluor ® 488 Anti-Maus-IgG (1:400, Thermo Fisher Scientific, Katalog # A-11001) als sekundären Antikörper; monoklonales Maus-IgG als Isotypkontrolle verwenden.
PBS 1x	Thermo Fisher Wissenschaftlich	18912014	Wird zum Waschen von Schritten verwendet
Formaldehyd (PFA) 16%	Thermo Fisher Wissenschaftlich	28908	Fixierung der Zellen
Glycin	Sigma-Aldrich	G8898	Wird im Blockierungspuffer verwendet
Rinderserumalbumin	Europa Bioproducts	EQBAH62-1000	Blockierungsmittel zur Verhinderung der unspezifischen Bindung von Antikörpern in Immunfärbeassays und CDM-Inhaltsstoff