Alle Verfahren, die die Probenentnahme beinhalten, wurden in Übereinstimmung mit den IRB-Richtlinien des Instituts durchgeführt.
1. Messung von Luciferase-Reportersignalen, die der γ-Sekretase-Spaltung von APP-C99 (Amyloid-Vorläuferprotein - C-terminales 99-Aminosäurefragment)
HINWEIS: Bitte beziehen Sie sich auf die früheren Veröffentlichungen für detaillierte Beschreibungen der Erzeugung von CG-Zellen (C99-Gal4).
- Aussaat von CG-Zellen (20.000 Zellen/Well) auf 96-Well-Mikrotiterplatten mit einem Endvolumen von 200 μl/Well in einem Wachstumsmedium, das aus Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) plus 10 % fötalem Rinderserum (FBS), 5 μg/mL Blasticidin, 250 μg/ml Antibiotikum (, z. B. , Zeocin) besteht, und 200 μg/ml Hygromycin B.
- Zählen Sie Zellen mit einem Hämozytometer.
- Gib die Mikrotiterplatten in einen befeuchteten CO2 Inkubator und inkubiere sie über Nacht bei 37 °C.
- Entfernen Sie 100 μl Wachstumsmedium aus jeder Vertiefung.
- 100 μl/Vertiefung Wachstumsmedium mit 2 μg/ml Tetracyclin mit entweder 0,2 % Dimethylsulfoxid (DMSO), 2 μM CL-387,785, 2 μM N-[N-(3,5-difluorphenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycin-t-butylester (DAPT) oder anderen verwandten ErbB1/ErbB2-Inhibitoren hinzufügen.
- Inkubieren Sie behandelte CG-Zellen in Mikrotiterplatten bei 37 °C für 24 h.
- Entfernen Sie 150 μl/Well-Wachstumsmedium von Mikrotiterplatten.
- Fügen Sie 50 μl/Well-Luciferase-Assay-Reagenz hinzu (siehe Tabelle der Materialien).
- Übertragen Sie die Mikroplatten auf einen Lumineszenz-Mikroplatten-Reader.
- Halten Sie die Mikrotiterplatten 5 Minuten lang unter leichtem Rühren bei Raumtemperatur.
- Bestimmen Sie die von Firefly emittierte Luziferase (FL)-emittierte Lumineszenz mit einem vordefinierten Programm, das im Lumineszenz-Mikroplatten-Reader gespeichert ist.
