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Alle Verfahren mit Tierproben wurden von der zuständigen Kommission für ethische Überprüfung der Tiere überprüft und genehmigt.
1. Schneiden des Gehirns
- Zur Immobilisierung und Betäubung von Mäusen durch Anwendung von 3% Isofluran.
- Tränken Sie einen Wattebausch mit Tropfen Isofluran und geben Sie ihn in ein 15-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Legen Sie die Nase des Tieres in das Röhrchen und lassen Sie es das Isofluran inhalieren. Überprüfen Sie die Tiefe der Anästhesie anhand der fehlenden Reaktion auf das Einklemmen der Zehen.
- Legen Sie das Tier auf den Rücken und fixieren Sie es, indem Sie seine Gliedmaßen mit einer T-Nadel festnageln, während Sie Zugang zu seinem Bauch haben.
- Schneiden Sie das Tier mit einer chirurgischen Schere ab, schneiden Sie die Bauchhaut ab und schneiden Sie die Haut im Brustbereich durch. Stecken Sie die Haut mit T-Pins fest. Brechen Sie dann die Peritonealmembran bis zum Thorax auf. Legen Sie das Herz frei, indem Sie die Brusthöhle knacken und das Zwerchfell durchtrennen.
- Schneide den rechten Vorhof ab, damit das Blut aus dem Tier abfließen kann. Führen Sie eine 10-ml-Spritze mit einer 25-Gauge-Nadel in den linken Ventrikel ein und perfundieren Sie sie mit 10 mL phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
HINWEIS: Dies ermöglicht es der Lösung, durch den systemischen Kreislauf zu fließen und durch den rechten Vorhof auszutreten.
- Entfernen Sie die 10-ml-Spritze und führen Sie eine 25-Gauge-Nadel ein, die an der 60-ml-Spritze befestigt ist. Perfundierte durch den linken Ventrikel mit 50 mL eiskaltem 4%igem Paraformaldehyd (PFA).
- Bereiten Sie eiskalte 4%ige PFA-Lösung zu, indem Sie 10%ige PFA-Lösung in H2O verdünnen und die endgültige 4%ige PFA-Lösung bei 4 °C abkühlen.
- Isolieren Sie den Kopf der Maus und entfernen Sie das Gehirn aus dem Schädel.
- Schneide die Haut vom Hals ab und schneide dann in Richtung der Augen, um den Schädel freizulegen. Knacken Sie den Schädel vom Hals bis zur Nase und dann von einem Augapfel zum anderen. Schälen Sie den Schädel heraus und entfernen Sie das gesamte Gehirn.
- Inkubieren Sie das Gehirn 24 Stunden lang bei 4 °C in 4 % PFA.
- Übertragen Sie das Gehirn mit einer Pinzette in ein konisches 50-ml-Röhrchen, das mit 25 mL 30%iger Saccharoselösung gefüllt ist. Halten Sie es 48-72 Stunden lang bei 4 °C, bis das Gehirn auf den Boden der Röhre sinkt.
- Schneiden Sie das Gehirn mit einem adulten Maushirnschnitt koronal durch das Mittelhirn (~3 mm posterior des Bregmas). Behalten Sie den Gehirnabschnitt, der den Hirnstamm enthält.
HINWEIS: Dies führt zu zwei Hirnabschnitten – einer mit dem größten Teil des Kortex (vorderer Teil des Schnitts) und einer mit dem Hirnstamm/Kleinhirn (hinterer Teil des Schnitts). Verwenden Sie den Hirnstammbereich für die folgenden Schritte.
- Betten Sie den Hirnstammabschnitt mit der Schnittfläche ein, die auf dem Boden einer Einbettungsform platziert ist, umgeben von einer Verbindung mit optimaler Schnitttemperatur (OCT); Stellen Sie das eingebettete Gehirn in einen -80 °C Gefrierschrank und frieren Sie es mindestens 12 h lang ein – bis zur weiteren Verwendung.
- Schneiden am Kryostaten: Setzen Sie die Einbettform, die das Gehirn in OCT enthält, in den Kryostaten ein; Inkubieren Sie es mehrere Stunden lang im Kryostaten, um die Temperatur des Gehirnblocks an die des Kryostaten anzupassen.
- Ziehen Sie die Einbettungsform ab, um den OCT-Block freizulegen, der das Gehirn enthält.
- Verwenden Sie Rasierklingen, um überschüssiges OCT von der Oberfläche des Blocks zu entfernen, ohne das Gehirn zu berühren.
- Montieren Sie den OCT-Block auf dem Spannfutter des Kryostaten und legen Sie die Schnittfläche des Gehirns nach vorne frei.
- Stellen Sie die Schnittfläche des Gehirns so ein, dass sie parallel zu den Rasierklingen des Kryostaten ausgerichtet ist.
- Trimmen Sie das Gehirn beginnend an der Medulla und schneiden Sie 100 μm große Schnitte rostral.
- Trimmen Sie rostral, bis das Kleinhirn und der Hirnstamm als eine durchgehende Scheibe geschnitten sind. Beginnen Sie mit dem Sammeln von Scheiben mit einer Dicke von 50 μm.
HINWEIS: Wenn man das Rückenmark rostral abschneidet, werden der Hirnstamm und das Kleinhirn in zwei getrennten Abschnitten geschnitten. In den rostralen Abschnitten verschmelzen Hirnstamm und Kleinhirn schließlich auf Höhe des 4. Ventrikels. Sobald die seitlichen Ränder des 4. Ventrikels gut geformt sind, kommen das Kleinhirn und der Hirnstamm als eine durchgehende Scheibe heraus.
- Entnehmen Sie eine OCT-umgebene Hirnscheibe mit einer Pinzette und legen Sie sie in eine Vertiefung einer 24-Well-Platte, die mit PBS gefüllt ist (Abbildung 1a). Der Locus coeruleus (LC) ist am prominentesten, wenn das Kleinhirn und der Colliculus inferior bei ~-5,52 mm posterior des Bregmas aufeinandertreffen (Abbildung 2b).
ANMERKUNG: Der vorderste Teil des LC verschwindet, sobald das Kleinhirn vollständig durchtrennt wurde, und umgibt den Colliculus inferior nicht mehr bei ~-5,34 mm posterior des Bregmas (Abbildung 2c).
2. Immunhistochemie für Dopamin-β-Hydroxylase (DBH) oder Tyrosin-Hydroxylase (TH) (Abbildung 1)
- Tag 1
- Waschen Sie die ausgewählten Scheiben dreimal für 5 min in PBS.
- In 0,5 % phosphatgepufferter Kochsalzlösung mit Detergens (PBSD) bei 4 °C 24 h permeabilisieren.
- Verdünnen Sie 125 μl Reinigungsmittel in 25 ml PBS.
- Tag 2
- Waschen Sie die Scheiben dreimal für 5 Minuten in 0,5 % PBSD.
- Den Primärantikörper, Anti-DBH oder Anti-TH, wird 18 h lang in einer Verdünnung von 1:500 in 0,5 % PBSD bei 4 °C zugegeben.
- Tag 3
- Waschen Sie die Scheiben dreimal für 10 Minuten in 0,5 % PBSD.
- Den gewünschten Sekundärantikörper (488 Esel Anti-Kaninchen für grüne Fluoreszenz) in einer Verdünnung von 1:1000 in 0,5 % PBSD für 16 h zugeben.
- Wickeln Sie die 24-Well-Platte in Aluminium ein und stellen Sie sie bei 4 °C auf.
- Waschen Sie die Scheiben dreimal für 5 Minuten in 0,5 % PBSD.
- 5 min in PBS waschen.
- Die Scheiben mit einem Bleistiftpinsel in einen Wasserbehälter geben.
- Montieren Sie im Wasser schwimmende Scheiben auf geladenen Objektträgern.
- Deckglasabschnitte mit harthärtendem Eindeckmedium Dopamin-Beta-Hydroxylase
- Trocknen Sie die montierten Hirnteile 30 min lang bei Raumtemperatur.
- Bilden Sie Gehirnschnitte an einem konfokalen oder fluoreszierenden Mikroskop mit Einstellungen zur Erkennung von Signalen der geeigneten Fluorophorwellenlänge von Sekundärantikörpern.
- Stellen Sie das Mikroskop auf die Brennebene des Gehirnschnitts ein und nehmen Sie ein einzelnes Bild mit 10-facher Vergrößerung auf.
