Eine Methode zur Zufügung eines geschlossenen Kopf-Schädel-Hirn-Traumas bei Drosophila

1. Aufbau des HIT-Gerätes

1. Befestigen Sie die Feder mit zwei Klemmen und vier Schrauben an der Platine (Abbildung 1A). Zentrieren Sie die Klammern relativ zur Breite der Platte und stoßen Sie sie mit der äußeren Klemme bündig mit der Brettkante aneinander. Bevor Sie die Klemmen anbringen, biegen Sie sie mit einer Zange so, dass sie fest über der Feder sitzen.
   HINWEIS: Siehe Tabelle 1 für Beschreibungen der Materialien, die für den Bau des HIT-Geräts benötigt werden. Das geklemmte Ende der Feder sollte 3,2 mm (1/8 Zoll) von der Kante der Platine entfernt sein, und das freie Ende sollte sich um 19 mm (3/4 Zoll) über die Platine erstrecken. Stellen Sie die Feder so ein, dass sie parallel zur Länge des Brettes liegt.
2. Wickeln Sie das freie Ende der Feder einmal mit dem Klebestreifen der Velcro-Schlaufen um. Die Außenkante des Velcro sollte bündig mit dem Ende der Feder abschließen. Der Velcro ist wichtig, da er verwendet wird, um das Fläschchen an der Feder zu befestigen, indem eine feste Kompressionsverbindung entsteht. Der Velcro ermöglicht auch ein einfaches An- und Entnehmen von Fläschchen, so dass viele Fläschchen in kurzer Zeit verarbeitet werden können.
3. Legen Sie die Eiskübelabdeckung auf den Kopf, zentriert, fest gegen das Holzbrett. Richten Sie den erhabenen Bereich der Eiskübelabdeckung so aus, dass die lange Kante parallel zur Breite des Bretts verläuft. Beachten Sie, dass der erhabene Bereich des Eiskübels 13 mm (1/2 Zoll) höher ist als das Holzbrett, so dass die Feder nicht flach auf dem Brett liegt, wenn ein Fläschchen an der Feder befestigt wird.
4. Schieben Sie das gesamte Gerät gegen einen festen Gegenstand, z. B. eine Wand, so dass die Abdeckung des Eiskübels zwischen dem Brett und dem Objekt eingeklemmt ist und sich nicht bewegt.
5. Kleben Sie den Papierwinkelmesser an den Boden eines Fliegenfläschchens aus Pappe und stellen Sie es hochkant gegen die Länge des Bretts, so dass die 90°-Markierung mit der Feder ausgerichtet ist, wenn es in eine perfekt vertikale Position zurückgezogen wird.

2. Betrieb des HIT-Geräts

1. Legen Sie zwischen 1 und 60 CO₂-betäubte Fliegen in ein leeres Fläschchen und verschließen Sie das Fläschchen mit einem eng anliegenden Wattebausch.
2. Beschränken Sie die Fliegen auf den Boden von 2,5 cm (1 Zoll) des Fläschchens, indem Sie den Wattebausch in das Fläschchen schieben, bis er 2,5 cm (1 Zoll) vom Boden entfernt ist. Es ist hilfreich, eine Linie auf das Fläschchen bei der 1-Zoll-Markierung (2,5 cm) zu zeichnen. Beachten Sie, dass die Beschränkung von Fliegen auf größere oder kleinere Bereiche der Durchstechflasche den Schweregrad der Phänotypen beeinflussen kann.
3. Warte 5 Minuten, bis die Fliegen ihre Beweglichkeit vom CO₂ wiedererlangt haben. Es ist nicht bekannt, ob 5 min ausreichen, um die Auswirkungen von CO₂ vollständig zu beseitigen.
4. Führen Sie das Ende der Feder in das Fläschchen ein, bis der Innenrand des Velcro bündig mit der Oberseite des Fläschchens abschließt (Abbildung 1B). Wenn die Feder flach aufliegt, sollte 1 Zoll (2,5 cm) des Fläschchens den erhabenen Bereich der Eiskübelabdeckung überlappen. Fläschchen können viele Male wiederverwendet werden.
5. Halten Sie das Fläschchen im Sitzen mit dem Daumen und Zeigefinger Ihrer linken Hand in den Velcro-Bereich. Halten Sie das Brett mit der rechten Hand fest an der Arbeitsplatte. Alternativ können Sie C-Klemmen verwenden, um das Brett fest an der Tischplatte zu halten.
6. Ziehen Sie die Feder perfekt gerade in den gewünschten Winkel zurück. Lassen Sie die Feder los. Lassen Sie die Feder vollständig zum Stillstand kommen.
7. Nehmen Sie das Fläschchen aus der Feder und lassen Sie die Fliegen ≥5 Minuten ruhen. Setzen Sie die Fliegen einem weiteren Schlag aus oder setzen Sie die Fliegen in ein Fläschchen mit Fliegenfutter um.
   HINWEIS: Eine Vielzahl von Assays kann verwendet werden, um die phänotypischen Auswirkungen von Schlägen mit dem HIT-Gerät zu bewerten. Zum Beispiel können Auswirkungen auf die Langlebigkeit durch die Analyse des Prozentsatzes der Fliegen, die zeitweise nach einer Verletzung überleben, Auswirkungen auf die Gehirnmorphologie können durch histologische Analyse des Kopfes bestimmt werden, und Auswirkungen auf die Genexpression können durch quantitative Analyse der mRNA-Spiegel bestimmt werden.
8. Bestimmen Sie die Auswirkungen des Verfahrens, die nicht auf Schläge zurückzuführen sind, indem Sie Kontrollfliegen, die keinen Schlägen ausgesetzt sind, identisch behandeln. Tragen Sie einen Gehörschutz, da der Aufprall des Fläschchens auf den Eiskübeldeckel ein lautes Geräusch erzeugt.

Abbildung 1: Diagramm des HIT-Geräts. (A) Illustration der Draufsicht auf das HIT-Gerät in Ruheposition. (B) Illustration der Seitenansicht des HIT-Geräts. Die Feder ist in Ruhestellung (dunkelrot) dargestellt und um 90° (hellrot) ausgelenkt.