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Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom örtlichen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
1. Präoperativer Eingriff
- Wischen Sie vor Beginn der Operation alles mit 70% Ethanol ab, um sterile Bedingungen zu erhalten. Eine thermische Unterstützung mit einem Heizkissen wird empfohlen.
- Betäuben Sie die Mäuse durch intraperitoneale Injektion von Chloralhydrat (400 mg/kg). Die Anästhesie ist durch eine Zehenklemme zu bestätigen. Die Anwendung von Meloxicam SR bei der Einleitung und von Buprenorphin nach der Genesung BID (bis in die, zweimal täglich) für mindestens 24 Stunden wird empfohlen.
- Rasieren Sie die Haare mit einer chirurgischen Haarschneidemaschine. Befestigen Sie eine Maus in der Maus und den Rattenadapter für Neugeborene mit Ohrstangen und einer Nasenklemme.
HINWEIS: Es ist wichtig sicherzustellen, dass der Mauskopf zu diesem Zeitpunkt gesichert ist und sich nicht nebeneinander bewegt.
- Tragen Sie Tierarztsalbe auf die Augen auf, um Trockenheit unter Narkose zu verhindern.
2. Stereotaktische Chirurgie zur Implantation von Führungskanülen
- Setzen Sie den Adapter für Maus und Neugeborenen-Ratte auf das stereotaktische Gerät. Machen Sie mit einem Skalpell einen sagittelen Schnitt auf der Haut über dem Schädel. Wischen Sie das Blut und das Bindegewebe am Schädel mit einem feuchten Wattestäbchen ab.
- Bestimmen Sie die Koordinate für die interessierende Hirnregion mit dem Gehirnatlas. Stellen Sie vor Beginn der Messungen sicher, dass die Mittellinie gerade ist, damit der Bohrer von A-P bewegt werden kann und die ganze Zeit auf der Mittelliniennaht verbleibt.
HINWEIS: In diesem Artikel wird die Koordinate (A/P: -3,1 mm, M/L: -2,5 mm, D/V: -1,2 mm, 12 Grad) verwendet, um den hinteren Hippocampus zu bestimmen.
- Ebene Schädel A-P
- Befestigen Sie einen Bohrer an einem Manipulator eines stereotaktischen Rahmens. Senken Sie den Bohrer ab, bis er das Lambda leicht berührt, und notieren Sie seine Bauchkoordinate. Wiederholen Sie diesen Vorgang für Bregma.
HINWEIS: Wenn der Schädel nivelliert ist, entspricht die vertikale Messung von Bregma der von Lambda. Wenn nicht, passen Sie die Höhe der Nasenklemme entsprechend an. Nachdem der Schädel nivelliert wurde, notiere die anteriore/hintere, laterale Koordinate des Bregmas.
- Ebener Schädel links-rechts
- Bewegen Sie den Bohrer vom Bregma zur Koordinate (Anteroposterior [A/P]: -3,1 mm, mediolateral [M/L]: +2,0 mm), senken Sie den Bohrer auf den Schädel ab und notieren Sie die vertikale Koordinate. Wiederholen Sie dann diesen Vorgang für die Koordinate (A/P: -3,1 mm, M/L: -2,0 mm).
HINWEIS: Wenn der Schädel nivelliert ist, sind diese vertikalen Maße von zwei äquidistanten Punkten von der Mittellinie gleich. Wenn nicht, passen Sie die Höhe der Ohrbügel an.
- Bohren Sie vorsichtig ein Fräsloch an der Zielkoordinate (A/P: -3,1 mm, M/L: -2,5 mm), um eine Führungskanüle zu implantieren. Wenn der Durchmesser eines Fräslochs nicht groß genug für eine Führungskanülenimplantation ist, bohren Sie ein weiteres Loch, das sich mit dem ersten überschneidet. Bohren Sie ein weiteres Loch in den rechten (kontralateralen Seite) Parietalknochen und setzen Sie eine Knochenschraube ein, die hilft, Zahnzement in 1.10 zu befestigen (siehe Abbildung 1B).
- Schneiden Sie mit einer Rasierklinge ein kreisförmiges Verriegelungsstück von der Rückseite des Deckels eines 1,5-ml-Zentrifugenröhrchens ab und formen Sie eine "Krone". Diese Krone wird verwendet, um zu verhindern, dass sich Zahnzement auf der Haut ausbreitet. Platzieren Sie es so auf dem Schädel, dass die in Schritt 2.5 gemachten Bohrlöcher innerhalb des Kreises bleiben (siehe Abbildung 1).
- Richten Sie eine stereotaktische Baugruppe ein, indem Sie eine Führungskanüle auf den kürzeren Arm eines stereotaktischen Adapters setzen und diese mit einer Hutmutter befestigen. Setzen Sie den längeren Arm des stereotaktischen Adapters auf die Elektrodenklemme. Befestigen Sie es am Manipulator des stereotaktischen Apparats (siehe Abbildung 1A).
- Drehen Sie die dorsal-ventrale (D-V) Stereotax-Baugruppe am Manipulatorarm um 12 Grad (siehe Abbildung 1B). Die Führungskanüle in das in Nummer 1.6 hergestellte Bohrloch einschieben. Führen Sie die Führungskanüle langsam in das Gehirn ein, indem Sie sie um 1,2 mm absenken.
HINWEIS: Der Winkel der Sonde ist spezifisch für den Hippocampus; Andere Regionen erfordern möglicherweise andere Winkel oder gar keinen Winkel. Konsultieren Sie einen Gehirnatlas für genaue Koordinaten. Trocknen Sie die Oberfläche des Schädels, denn wenn nicht, haftet der Zement nicht und die Zementkappe kann sich lösen
- Fügen Sie den Zahnzement in die Krone ein, um sowohl den Metallteil der Führungskanüle als auch die Knochenschraube vollständig genug zu bedecken, um sie zu sichern. Tragen Sie zusätzlichen Zahnzement auf, wenn ein Teil des Schädels freiliegt.
- Warten Sie, bis der Zahnzement vollständig getrocknet ist (~12-20 min). Entfernen Sie den stereotaktischen Adapter von der Elektrodenklemme. Entfernen Sie die Überwurfmutter, ersetzen Sie den stereotaktischen Adapter durch eine Dummy-Sonde und befestigen Sie die Überwurfmutter.
- Befreien Sie die Maus aus dem stereotaktischen Apparat und halten Sie die Maus allein in einem individuellen Käfig.
ANMERKUNG: Die Maus sollte nicht unbeaufsichtigt gelassen werden, bis sie wieder genügend Bewusstsein erlangt hat, um die Brustbeinlage aufrecht zu erhalten. Kontrollieren Sie die Maus täglich bis zum Tag der Mikrodialyse. Die Maus erhält nichtsteroidale Antirheumatika (NSAIDs) wie Carprofen, wenn sie Schmerzen zu haben scheint. Eine Wartezeit von 2 Wochen ist für Schlaf-Wach-Studien notwendig, damit sich die Maus an die neue Umgebung gewöhnt, aber andere Arten von Studien können kürzere Erholungsphasen erfordern (, z. B. 1-2 Tage).
3. Einrichtung der Mikrodialyse
- Qualitätskontrolle der Sonden: Füllen Sie eine 1ml Einwegspritze mit destilliertem Wasser und verbinden Sie diese mit einem Byton-Schlauch mit dem Auslass (kürzerer Port) einer Sonde. Decken Sie die Entlüftungslöcher mit den Fingern ab und drücken Sie den Spritzenkolben leicht an, um die Sonde mit Wasser zu versorgen. Vergewissern Sie sich, dass Wasser aus dem Sondeneinlass austritt und keine Leckagen auf der Oberfläche einer Mikrodialysemembran vorhanden sind.
- Aktivierung der Sonden: Tauchen Sie die Membranen einer Sonde zwei Sekunden lang in Ethanol (70-100%). Gießen Sie dann destilliertes Wasser erneut mit einer Spritze in die Sonde.
- Herstellung des Perfusionspuffers: Um eine Adhäsion der Zielmoleküle an den Schläuchen zu vermeiden, fügen Sie BSA hinzu, indem Sie 30%ige BSA-Lösung auf 4% mit künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit verdünnen (aCSF: 1,3 mM CaCl2, 1,2 mM MgSO4, 3 mM KCl, 0,4 mM KH2PO4, 25 mM NaHCCO3, 122 mM NaCl, pH=7,35), was der Elektrolytkonzentration im Liquor unmittelbar vor der Anwendung sehr nahe kommt. Filtrieren Sie den Perfusionspuffer durch eine Spritzenvorsatzfiltereinheit mit 0,1 μm Porengröße.
HINWEIS: 4% Rinderserumalbumin (BSA) verbessert die Wiederfindung für anhaftende Proteine, kann aber die Abgabe von Verbindungen stark einschränken, insbesondere bei Verbindungen mit hoher BSA-Bindung. Dies ist ein Vorteil der Verwendung einer niedrigeren BSA-Konzentration (z. B. 0,15 %) in bestimmten Fällen. Es ist zu beachten, dass BSA sehr leicht aggregieren kann, wenn es durch einen Wirbel oder eine Rührplatte bewegt wird. Diese Aggregate können Sonden oder Membranporen verstopfen. Seien Sie vorsichtig, wenn Sie eine BSA-Lösung vorbereiten, um diese Aggregation zu begrenzen
- Bereiten Sie zwei getrennte Leitungen für Ein- und Auslass vor (siehe Abbildung 1C) und verbinden Sie beide Leitungen mit einer Verbindungsnadel. Füllen Sie eine mit Perfusionspuffer gefüllte 3-ml-Einwegspritze und verbinden Sie sie mit einer stumpfen Nadel mit dem Einlassende des Schlauchs. Füllen Sie den gesamten Schlauch mit einem Perfusionspuffer, indem Sie die Spritzenpumpe laufen lassen.
- Stoppen Sie die Spritzenpumpe und ersetzen Sie die Verbindungsnadel zwischen Einlass- und Auslassleitung durch eine aktivierte Mikrodialysesonde aus Schritt 3.3 (siehe Abbildung 1C). Setzen Sie vor diesem Austausch die Überwurfmutter auf die Sonde.
- Montieren Sie das Rollenrohr in den Auslassschlauch der Rollenpumpe. Starten Sie die Spritzenpumpe bei 10 μL/min und dann die Rollenpumpe mit der etwas langsameren Durchflussrate (9,5-9,8 μL/min). Achten Sie darauf, alle Luftblasen im gesamten Schlauch zu entfernen, die die Erholung beim Eintritt in die Sonde beeinträchtigen können.
- Betäuben Sie die Maus aus Schritt 1.12 auf die gleiche Weise wie in Schritt 1.2. Legen Sie ihm das Maushalsband um den Hals. Entfernen Sie die Überwurfmutter und den Sondendummy, führen Sie langsam eine Mikrodialysesonde aus 3.4 durch die Führungskanüle ein und befestigen Sie die Überwurfmutter.
- Legen Sie die Maus in den Käfig, der mit einem frei beweglichen System verbunden ist, und binden Sie die Maus mit dem Halsband an. Sowohl die Spritzenpumpe als auch die Rollenpumpe mindestens 1 h lang mit der in Schritt 3.5 angegebenen Durchflussmenge laufen lassen.
HINWEIS: Um eine ISF-Sammlung von wachen Tieren zu erreichen, verwendet dieser Artikel ein frei bewegliches System, bei dem der Käfig selbst auf die Bewegung eines Tieres reagiert, um zu verhindern, dass sich die Schläuche verdrehen. Alternativ können auch Flüssigwirbel verschiedener Hersteller verwendet werden.
- Stoppen Sie zuerst die Rollenpumpe und dann die Spritzenpumpe. Stellen Sie die gewünschte Durchflussmenge ein. Lassen Sie die Spritzenpumpe 20 % schneller laufen als die Rollenpumpe.
HINWEIS: Wenn Sie beispielsweise mit 1 μl/min arbeiten, betreiben Sie die Spritzenpumpe mit 1,2 μl/min. Die optimale Flussrate sollte empirisch für jedes Molekül bestimmt werden.
- Sammeln von ISF-Proben: Legen Sie das freie Ende des Auslassschlauchs auf den Auffangbehälter für die gekühlte Fraktion.
HINWEIS: Das geeignete Probenvolumen variiert je nach den für die Analyse verwendeten Assays.
- Entfernen Sie nach Abschluss des Experiments die Sonde. (Betäuben Sie die Maus nach Bedarf.)Behandeln Sie die Mauswiederherstellung auf die gleiche Weise wie in Schritt 2.11. Analysieren Sie die gesammelten ISF mit Methoden wie der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) oder dem Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA).
- Um den gesamten Schlauch nach der Mikrodialyse zu waschen, verbinden Sie die Ein- und Auslassschläuche erneut, indem Sie die Sonde durch die Verbindungsnadel ersetzen und das verdünnte Bleichmittel in den gesamten Schlauch laufen lassen und dann mit Wasser spülen. Trocknen Sie es und lagern Sie es für den wiederholten Gebrauch.
HINWEIS: Andere Arten von Schläuchen sind akzeptabel, jedoch kann BSA in Perfusionspuffer die Schläuche mit kleinem Durchmesser verstopfen, daher werden diese Schläuche als Einwegschläuche betrachtet. Die Schläuche können nach mehrmaligem Gebrauch abgenutzt oder verstopft sein, stellen Sie also sicher, dass die Durchflussrate vor dem Gebrauch jedes Mal konstant ist.
