1. Fluoreszenzmarkierung von Zellen
HINWEIS: Markieren Sie Glioblastom-Zelllinien und Mikroglia mit Fluoreszenzfarbstoffen 9. Alternativ können Zelllinien erzeugt werden, die konstitutiv fluoreszierende Proteine wie GFP/RFP exprimieren.
- Plattenzellen auf einer 6-Well-Platte, so dass sie am Tag der Färbung zu 70 - 80 % konfluent sind. Für die murine Glioblastom-Zelllinie GL261 und die humane Glioblastom-Zelllinie U87 werden 1 x 106 bzw. 1,5 x 106 Zellen 24 Stunden vor der Färbung auf einer 6-cm-Schale gezeigt.
- Bereiten Sie eine fluoreszierende Zellfärbelösung in DMSO (Dimethylsulfoxid) vor und fügen Sie dem Medium 5 μM Farbstoff hinzu, entweder Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI) oder Macrophage Serum Free Medium (MSFM), und vertexen Sie es gut.
- Die Zellen werden 30 Minuten lang bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert.
- Entfernen Sie farbstoffhaltige Medien und fügen Sie den Zellen frische Medien (RPMI oder MSFM) hinzu.
- Inkubieren Sie die Zellen 30 Minuten lang. Hinweis: Die Zellen sind nun gefärbt und können im Experiment verwendet werden.
2. Invasionsassay "3D"-Einbettung von Gliomen und Makrophagen/Mikroglia in die Matrix
- Matrixmischung über Nacht bei 4 °C auftauen. Führen Sie alle weiteren Manipulationen mit einer Matrix auf Eis in der Haube durch.
- Bereiten Sie eine Konzentration von 10 mg/ml der Matrix in einem Medium (MSFM oder RPMI) mit 0,3 % BSA auf Eis vor.
HINWEIS: Die Stammkonzentration der Matrix liegt typischerweise bei etwa 15 mg/ml.
- Um Zellen (in Schritt 1 markiert) für die Suspension in der Matrix vorzubereiten, entfernen Sie das Medium durch Aspiration aus den Zellen. Waschen Sie die Zellen auf einer Schale mit 2 mM EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure)/PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung). 500 μl 2 mM EDTA/PBS in die Zellen geben und 5 - 10 min bei 37 °C und 5 % CO2 inkubieren.
- Resuspendieren Sie die Zellen in 5 ml Medien mit einem Gehalt von 0,3 % BSA.
- 5 min bei 120 x g zentrifugieren.
- Saugen Sie den Überstand aus dem Pellet ab. Resuspendieren Sie das Pellet in Medien/0,3 % BSA so, dass die Konzentration der Zellen 1 x 106 Zellen/ml entspricht. Verwenden Sie ein Hämozytometer, um die Zellen zu zählen.
- Geben Sie 1,5 x 105 GL261-Zellen (in 150 μl) + 5 x 104 Mikrogliazellen (in 50 μl) in ein 1,5-ml-Mikrofuge-Röhrchen. 2 x 105 GL261 Zellen (200 μl) in ein separates 1,5 ml Mikrofuge-Röhrchen geben.
HINWEIS: GL261-Zellen allein ohne Mikroglia dienen als Kontrolle.
- Zellen in einer Mikrofuge für 5 min bei 120 x g drehen.
- Resuspendieren Sie die Zellen in 200 μl kalter Matrix auf Eis.
- Platte 50 μl (50.000 Zellen) auf die Mitte des oberen Fachs des Kammereinsatzes mit 8 μM Porengröße.
- Inkubieren Sie 30 Minuten lang bei 37 °C, damit die Polymerisation stattfinden kann.
- Geben Sie 200 μl serumfreies Medium in die obere Kammer und 700 μl serumhaltiges Zellwachstumsmedium in die untere Vertiefung.
- Inkubieren bei 37 °C, 5 % CO2 für 48 Std.
- Entfernen Sie nach der Inkubation die Zellen durch sanftes Absaugen von der Oberseite der Kammer und fixieren Sie die Kammern, indem Sie sie in 3,7 % Formaldehyd in PBS legen. Lassen Sie die Kammern 15 Minuten lang bei Raumtemperatur (oder über Nacht bei 4 °C) im Fixiermittel bleiben. Fixiermittel durch sanftes Absaugen entfernen und durch 500 μl 1x PBS ersetzen. Fahren Sie mit Abschnitt 4 zur Bildanalyse fort.
