Zika-Virus-Infektion von fötalen neuralen Stammzellen

Zusammenfassung

Quelle: McGrath, E. L., et al., Zika-Virusinfektion von kultivierten neuralen Stammzellen des menschlichen fötalen Gehirns für die immunzytochemische Analyse. J. Vis. Exp. (2018)

Dieses Video zeigt ein Verfahren zur Infektion menschlicher fetaler neuraler Stammzellen mit dem Zika-Virus. Die infizierten Zellen können für weitere Studien verwendet werden.

Protokoll

1. Zika-Virus-Infektion

HINWEIS: ZIKV reagiert sehr empfindlich auf Temperaturen, daher ist es zwingend erforderlich, dass ZIKV-Bestände bei -80 °C gelagert werden und Gefrier-/Auftauzyklen vermieden werden. Arbeite weiter mit Aliquoten auf Eis.

1. Durchgangszellen. Insgesamt werden 3-4 Millionen Zellen benötigt, um eine 24-Well-Platte zu säen, daher geben Sie beim Passaging die Anzahl der Zellen, die für die Infektion und Aussaat benötigt werden, in einen Kolben.
2. Wenn die Zellen zum Färben in eine 24-Well-Platte ausgesät werden, bereiten Sie die Platte vor [Die Vertiefungen mit Deckgläsern mit 0,01 % Poly-D-Lysin (PDL) in sterilem Wasser beschichten und 1 h bei 37 °C inkubieren. Verwenden Sie für eine 24-Well-Platte 250 μl PDL pro Well].
3. Nach der Passage 1 ml Zellsuspension in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen geben und bei 200 x g bei Raumtemperatur 5 Minuten zentrifugieren. Entfernen Sie dann den Überstand durch Aspiration.
4. Resuspendieren Sie das Zellpellet im ZIKV-Lagerbestand, um eine Infektionsmultiplizität (MOI) von 1 bis 10 zu erreichen. Das Volumen der ZIKV-Lösung sollte 0,5 ml nicht überschreiten. Für die Scheinbehandlung (Kontrollzellen) resuspendieren Sie die Zellen im gleichen Volumen und in der gleichen Art von Medium, die im ZIKV-Material verwendet werden.
5. Über dem Gemisch aus Zelle und ZIKV bei 37 °C 1 h inkubieren. Drehen Sie das Röhrchen 2-3 Mal um und zentrifugieren Sie dann die Mischung 5 Minuten lang bei 216 x g bei Raumtemperatur, um ein Zellpellet zu erhalten. Das Pellet in dPBS resuspendieren und erneut 5 min bei 216 x g bei Raumtemperatur zentrifugieren.
6. Entfernen Sie den Überstand durch Aspiration, resuspendieren Sie die Zellen mit einem geeigneten Medium und laden Sie die infizierten Zellen in einen Kolben oder eine Platte, die für das Experiment benötigt werden. Wenn Sie die Zellen in eine 24-Well-Platte aussäen, resuspendieren Sie das Pellet in 12 ml geeignetem Medium und geben Sie dann 500 μl Suspension in jede Vertiefung.
   HINWEIS: An dieser Stelle halten Sie entweder die Zellen in Wachstumsmedien, um die Auswirkungen von ZIKV auf Stammzellen zu beobachten, oder gehen Sie zu Schritt 6 oder 7, um die Wirkung von ZIKV auf den Differenzierungsprozess zu untersuchen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
DMEM	Gibco	11965-092
F12	Gibco	11765-054
Glukose (10%)	Sigma	G8644
HEPES (1M)	Corning/cellgro	25-060-c1
Stift-Streptokokken (100x)	Gibco	15140-122
Kohlendioxid-Inkubator	Thermoforma	Modell# 3110
Zentrifuge	Thermo Fisher Wissenschaftlich	75004221
Biologische Sicherheitswerkbank	Forma scientific Claas II A/B3	Modell# 1284
Poly-D-Lysin-Hydrobromid(PDL)	Sigma	P6407-5MG
Laminin	Invitrogen	23017-015