Stimulation von sensorischen Neuronen des Spinalganglion mit Hilfe eines Neuropeptidrezeptor-Agonisten

Zusammenfassung

Quelle: Lin, Y., et al., Isolierung von Spinalwurzelganglien und Primärkultur zur Untersuchung der Neurotransmitterfreisetzung. J. Vis. exp. (2018)

Dieses Video zeigt die Verwendung von transfizierten Spinalganglienzellen zur Untersuchung der Neurotransmitterfreisetzung durch Stimulation mit einem Neuropeptidrezeptor-Agonisten.

Protokoll

1. Freisetzung von Neurotransmittern aus primären DRG-Zellen

1. An Tag 6, nachdem die Zellen plattiert wurden (72 h nach siRNA-Transfektion), wechseln Sie das Kulturmedium auf 200 μl serumfreies Medium und inkubieren Sie die Zellen in einem 37 °C CO₂ Inkubator für 30 Minuten.
2. Fügen Sie 1 μl Stimulationschemikalie(n) hinzu und mischen Sie das Medium vorsichtig durch Pipettieren. Inkubieren Sie die Schale für die angegebene Zeit in einem 37 °C heißen CO₂-Inkubator.
   HINWEIS: In diesem Artikel wurden die kultivierten Zellen mit dem NPFFR2-Agonisten dNPA (D.Asn-Pro-(N-Me)Ala-Phe-Leu-Phe-Gln-Pro-Gln-Arg- Phe-NH2, 5 nmol) für 1 h stimuliert.
3. Sammeln Sie das Nährmedium aus der Kulturschale und zentrifugieren Sie es 5 Minuten lang bei 5.000 x g, um alle suspendierten Verunreinigungen zu entfernen.
4. Entnehmen Sie den Überstand aus der Zentrifugation und verdünnen Sie die Proben nach Bedarf mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Verwenden Sie dann Enzymimmunoassay-Kits (EIA), um die Spiegel der Neurotransmitter zu testen.
   HINWEIS: Hier wurden die Überstände 1:100 verdünnt, bevor der CGRP-Gehalt analysiert wurde. Der Überstand wurde vor der Analyse des SP-Spiegels nicht verdünnt.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
DMEM-F12	Invitrogen	12400024	Kulturmedium
Hanks ausgewogene Salzlösung	Invitrogen	14170-112	Kulturmedium
Pasteur-Pipette	Hilgenberg	3150102	Verreibung von Zellen
dNPA	Gen-Synthese	N/A	NPFFR2-Agonist