Untersuchung der Lymphozytentransmigration durch eine mikrovaskuläre Endothelzell-Monoschicht

Zusammenfassung

Quelle: Schulte-Mecklenbeck, A., et al., Analyse der Lymphozytenextravasation unter Verwendung eines In-vitro-Modells der menschlichen Blut-Hirn-Schranke. J. Vis. exp. (2017)

Dieses Video zeigt eine experimentelle Untersuchung der Lymphozytentransmigration über ein Blut-Hirn-Schranke (BHS)-Endothelmodell. In vitro wird eine Monoschicht aus mikrovaskulären Endothelzellen (HBMECs) des menschlichen Gehirns erzeugt, und mononukleäre Zellen des peripheren Blutes (PBMCs), die Lymphozyten enthalten, werden der Monoschicht hinzugefügt. Die Zellen werden dann inkubiert, um eine Lymphozytentransmigration zu ermöglichen, und die migrierten Zellen werden mittels Durchflusszytometrie quantifiziert.

Protokoll

1. Vorbereitung der Zellkultureinsätze

1. Beschichtung von Zellkultureinsätzen
   Wichtiger Hinweis: Vermeiden Sie es, die Membran der Zellkultureinsätze zu berühren.
   1. Geben Sie 100 μl Fibronektinlösung zu jedem Zellkultureinsatz (Abbildung 1A) und eine Vertiefung einer 96-Well-Platte mit flachem Boden (optische Kontrollvertiefung). Mindestens 3 h bei 37 °C inkubieren. Nach der Inkubation Fibronektinlösung aspirieren.
   2. Geben Sie 100 μl HBMEC-Suspension in die Zellkultureinsätze und die optische Kontrollvertiefung. Geben Sie 600 μl Endothelzellmedium-Basalmedium (ECM-b) in das untere Kompartiment der Zellkultureinsätze. 3 - 4 Tage bei 37 °C / 5 % CO₂ inkubieren, bis die Integrität der Barriere erreicht ist (Abbildung 1B), das Zellwachstum durch mikroskopische Auswertung des HBMEC in der optischen Kontrollvertiefung überprüfen.
      Hinweis: Zellwachstum über vier Tage hinaus wird nicht empfohlen.

2. Migrations-Assay

1. Aufbereitung von mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMC).
   1. Geben Sie 10 mL Medium des Roswell Park Memorial Institute (RPMI) in ein 15 mL Zentrifugenröhrchen und fügen Sie 200 μl B27 hinzu. PBMC zählen und Zellen 5 Minuten lang bei 300 x g zentrifugieren. Resuspendieren Sie PBMC auf eine Endkonzentration von 5 x 10⁶ Zellen/ml RPMI/B27.
2. Aufbau des Migrationsassays
   1. Aspiratmedium aus dem unteren Kompartiment, gefolgt vom oberen Kompartiment von Zellkultureinsätzen, die konfluente HBMEC-Monoschichten enthalten (Abbildung 1A). Geben Sie pro Spender je 100 μl PBMC-Suspension zu den Zellkultureinsätzen und auch zu einer Vertiefung einer 24-Well-Platte pro (in vitro -Kontrolle).
   2. 600 μl RPMI/B27 in das untere Kompartiment der Zellkultureinsätze und 500 μl in die PBMC der -In-vitro-Kontrolle geben und 6 h bei 37 °C / 5 % CO_{2 inkubieren.}
3. Ernte von migrierten PBMC
   1. Nehmen Sie den Zellkultureinsatz mit einer Pinzette heraus und spülen Sie den Boden vorsichtig mit 400 μl phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) ab, ohne die Membran zu berühren. Entsorgen Sie den Zellkultureinsatz.
   2. Geben Sie 20 μl Fluorosphären (ca. 1.000 Kügelchen/μl) in das untere Kompartiment des Zellkultureinsatzes sowie in die In-vitro-Kontrolle und mischen Sie sie gut. Übertragen Sie 1 ml der resultierenden PBMC-Suspension in Durchflusszytometrieröhrchen.

3. Durchflusszytometrie

1. Probenvorbereitung
   1. Zentrifugieren Sie PBMC bei 300 x g für 5 min bei Raumtemperatur.
   2. Bereiten Sie die Antikörperlösung vor, indem Sie Fluorochrom-konjugierte Antikörper zu 100 μl Durchflusszytometriepuffer (PBS/1 % Rinderserumalbumin [BSA]/2 mM Ethylendiamintetraessigsäure [EDTA]) pro Probe hinzufügen. Für die unten dargestellten Ergebnisse wurden 1 μL CD4-FITC (Differenzierungscluster 4-Fluorescein-Isothiocyanat), 1 μL CD3-PerCP/Cy5.5 (Peridinin, Chlorophyllprotein/Cyanin 5.5), 1 μL CD56-PC7 (Phycoerythrin, Cyanin 7), 1 μL CD8-A700 (Alexa Fluor 700) und 1 μL CD16-A750 (Alexa Fluor 750) pro Probe verwendet.
   3. PBMC wird in 100 μl der Antikörperlösung resuspendiert und 30 min bei 4 °C inkubiert.
   4. 250 μl Durchflusszytometrie-Puffer zugeben und bei 300 x g für 5 min zentrifugieren.

Ergebnisse

Abbildung 1: Differentielle Migration von NK-Zell-Subsets über unentflammte und entflammte HBMEC-Monoschichten. A. Ein Bild der Transwell-Einsätze (links) und Illustration des Versuchsaufbaus (rechts). B. Validierung der HBMEC-Barrierefunktionen. Links: immunhistochemische Färbung des Tight-Junction-Moleküls ZO-1 mit Kaninchen-Anti-Human-Zonula Occludens-1 (ZO-1, abcam, 1:200) und An...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
PBS	Gibco	14190-094	ohne CaCl2 oder MgCl2
Fibronektin 1mg/ml	Sigma	F1141-5MG	aus Rinderplasma
HBMEC	ScienCell	1000
HBMEC	Pelobiotech	PB-H-6023
ECM-b	ScienCell	1001-b
FBS	ScienCell	1001-b
Penicillin/Streptomycin	ScienCell	1001-b
Nahrungsergänzungsmittel für das Wachstum von Endothelzellen	ScienCell	1001-b
Transwell	Corning	3472	klar, 6,5 mm Durchmesser, 3,0 μm Porengröße
96-Well-Platte mit flachem Boden	Corning	3596
B27	Gibco	17504-044	50x konzentriert
Platte mit 48 Vertiefungen	Corning	3526
RPMI 1640	Gibco	61870-010
Durchflusszählung Fluorsphären	Beckman Coulter	7547053
Na-EDTA	Sigma	E5134
BSA	Sigma	Nr. A2153
CD3-PerCP/Cy5.5	Biolegende	300430	Klon UCHT1
CD56-PC7	Beckman Coulter	A21692	Klon N901
CD16-A750	Beckman Coulter	A66330	Klon 3G8
CD4-FITC	Biolegende	300506	Klon von RPA-T4
CD8-A700	Beckman Coulter	Nr. A66332	Klon B9.11