Alle Verfahren, bei denen Tierproben verwendet werden, wurden von der zuständigen Kommission für die ethische Überprüfung der Tiere überprüft und genehmigt.
1. Bestimmung der Infarktzone
- Messung der Infarktzone (IZ) 24 Stunden nach dem Verschluss der mittleren Hirnarterie (MCAO).
HINWEIS: Ratten, die mehr als 20% ihres Gewichts verloren haben oder Krampfanfälle oder Hemiplegie entwickelt haben, sind vom Experiment ausgeschlossen.
- Euthanasieren Sie die Ratte, indem Sie das eingeatmete Gasgemisch durch 20 % Sauerstoff und 80 % Kohlendioxid ersetzen, bis die Ratte spontan aufhört zu atmen.
- Öffnen Sie den Brustkorb mit einem 5-6 cm langen seitlichen Schnitt durch die Bauchdecke unter dem Brustkorb mit einer Schere und einer chirurgischen Zange.
- Führen Sie mit einer Schere und einer chirurgischen Zange einen Zwerchfellschnitt über die gesamte Länge des Brustkorbs durch.
- Vorsichtig die Lunge verdrängen, rechts und links den Brustkorb bis zum Schlüsselbein durchschneiden.
- Perfundierte mit 200 ml normaler Kochsalzlösung durch den linken Ventrikel des Herzens.
- Punktion oder Schnitt in den rechten Vorhof des Herzens mit einer Schere.
- Führen Sie eine Enthauptung mit einer Guillotine durch und sammeln Sie Gehirngewebe.
- Schneiden Sie mit einer Irisschere beidseitig vom Foramen magnum bis zum distalen Rand der hinteren Schädelfläche.
- Trennen Sie die Riechkolben, die nervösen Verbindungen entlang der ventralen Oberfläche und der dorsalen Oberfläche des Schädels vom Gehirn.
- Entferne das Gehirn aus dem Kopf.
- Produziere 6 Gehirnschnitte, indem du mit einer unbeschichteten, einschneidigen Rasierklinge aus .009" Edelstahl 2 mm dicke horizontale Abschnitte erzeugst.
- 30 min bei 37 °C in 0,05 % TTC inkubieren.
- Legen Sie das Hirngewebe auf die Objektträger und führen Sie eine optische Abtastung dieser 6 Hirnschnitte mit einer Auflösung von 1600x1600 dpi durch (siehe z.B. Abbildung 1).
- Fügen Sie mit einem Bildbearbeitungsprogramm (z. B. Adobe Photoshop CS2) mit der Funktion "Kanalmixer" (Image > Adjustments > Channel Mixer) einen Blaufilter hinzu und speichern Sie das Bild im JPEG-Dateiformat.
HINWEIS: Nach dem Anwenden des Blaufilters erscheint das Bild in Graustufen.
- Öffnen Sie das gespeicherte Bild in ImageJ 1.37v.
HINWEIS: Dieses Computerprogramm verwendet eine Schwellenwertfunktion, um die Pixel zu isolieren und zu berechnen, die entweder schwarz oder weiß sind (siehe Abbildung 2).
- Wählen Sie für jede der 6 Gehirnschnitte des Bildes jede Hemisphäre (rechts verletzt ipsilateral und links unverletzt kontralateral) aus und speichern Sie sie als separate Bilddatei mit dem Werkzeug "Polygonauswahl" aus dem Hauptmenü.
- Stellen Sie den Cut-off für die Bestimmung der IZ ein, indem Sie eine automatische Schwellenwertfunktion aus dem Hauptmenü der ImageJ-Software verwenden, indem Sie Image > Adjust > Threshold auswählen und die Anzahl der Pixel in jeder Hemisphäre eines einzelnen Gehirnsatzes messen.
HINWEIS: Makros können für diesen Schritt in der ImageJ-Software verwendet werden (siehe Ergänzendes Dokument 1 für den Code). Der Cut-Off ist ein kritischer Parameter, um zu bestimmen, welche Pixel je nach Grauton in Weiß und welche in Schwarz umgewandelt werden sollen (siehe Abbildung 3 und Abbildung 4 als Beispiele). ImageJ vergleicht dann weiße und schwarze Pixel, um IZ zu bestimmen. Basierend auf dem Färbeprotokoll und den Scannereinstellungen haben wir einen konstanten Grenzwert von 0,220 verwendet.
- Führen Sie eine Messung der IZ-Korrektur für Gewebeschwellungen mit der RICH-Methode (Ratios of Ipsilateral and Contralateral Cerebral Hemispheres) durch (siehe Beispiel in Abbildung 5).
HINWEIS: Die Infarktgröße wird als Prozentsatz der kontralateralen Hemisphäre bewertet.
2. Bestimmung des Hirnödems
HINWEIS: Verwenden Sie ImageJ 1.37v zur Messung von Hirnödemen (BE).
- Messen Sie BE 24 h nach MCAO. Für die Berechnung von BE verwenden Sie die Daten des Volumens der linken und rechten Hemisphäre (in Einheiten).
- Führen Sie optische Scans mit einer Auflösung von 1600 x 1600 dpi durch (siehe z. B. Abbildung 1).
- Wählen Sie die Gehirnhälften aus und legen Sie den Cut-off für die Bestimmung von BE mit ImageJ 1.37v fest, wie oben in den Abschnitten 1.17-1.19 beschrieben.
- Drücken Sie die BE-Fläche als Prozentsatz der Standardbereiche der nicht betroffenen kontralateralen Hemisphäre aus, berechnet nach der RICH-Methode unter Verwendung der folgenden Gleichung (siehe Beispiel in Abbildung 5).
HINWEIS: Das Ausmaß der BE wird als Prozentsatz der kontralateralen Hemisphäre bewertet.
