Bewertung des transendothelialen elektrischen Widerstands in einem in vitro Blut-Hirn-Schrankenmodell

Zusammenfassung

Quelle: Kuzmanov, I., et al. Ein In-vitro-Modell der Blut-Hirn-Schranke mittels Impedanzspektroskopie: Ein Fokus auf die Interaktion zwischen T-Zellen und Endothelzellen. J. Vis. exp. (2016)

Dieses Video zeigt eine Methode zur Bestimmung des transendothelialen elektrischen Widerstands (TEER) in mikrovaskulären Endothelzellen des Mausgehirns in vitro. Ein hoher TEER-Wert deutet auf intakte Endothelzellverbindungen hin, während die Zugabe von aktivierten T-Zellen den TEER-Wert senkt, was eine Störung der Verbindungsbarriere widerspiegelt.

Protokoll

1. Einrichten und Durchführen der Messung des transendothelialen elektrischen Widerstands (TEER)

1. Platzieren Sie das 24-Well-Modul des transendothelialen elektrischen Widerstandsmessgeräts (TEER) unter der Laminar-Flow-Haube. Entfernen Sie die Deckel und setzen Sie mit einer Pinzette Einsätze mit primären mikrovaskulären Endothelzellen (MBMECs) des Mausgehirns in das Instrument ein.
2. Pipettieren Sie 810 μl frisches Medium in das untere Fach der Modulvertiefung: Geben Sie es vorsichtig zwischen den Einsatz und die Wand der Modulvertiefung.
3. Schließen Sie die Deckel und legen Sie das Instrument in den Inkubator. Schließen Sie das Gerät an seinen Computer an. Schalten Sie die Gerätesteuerung ein und öffnen Sie die Software.
4. Wählen Sie im Popup-Fenster "Neue Messung". Aktivieren Sie die Kontrollkästchen "show TEER" und "show Ccl". Drücken Sie dann auf "Start". Nachdem Sie die erste Messung abgeschlossen haben, wählen Sie auf der Registerkarte "Ergebnisse" die Option "Alle Wells überprüfen", um alle TEER- und Ccl-Werte (Cell Layer Capacity) anzuzeigen.
5. Speichern Sie die Datei: Datei>Speichern unter>' der Name Ihrer Datei'.
   HINWEIS: Da TEER und Ccl kontinuierlich und automatisch gemessen werden, überwachen Sie ihre Werte über einen Zeitraum von drei bis fünf Tagen. Ein Wechsel des Mediums ist nicht notwendig, es sei denn, die Zellviabilität ist suboptimal, wie durch einen fehlenden Anstieg der TEER visualisiert wird.
6. Wählen Sie den Zeitpunkt für die Co-Kultivierung von MBMECs mit T-Zellen, wenn Ccl stabil und niedriger als 1 μF/cm² ist und TEER seinen Höchstwert erreicht hat.
7. Überprüfen Sie die absoluten TEER- und Ccl-Werte sorgfältig und schließen Sie die Vertiefungen aus, in denen MBMECs keine ausreichend konfluenten Monoschichten entwickelt haben, indem Sie die Häkchen bei solchen Vertiefungen entfernen.
8. Gruppieren Sie den Rest der Vertiefungen: Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf eine Vertiefung und wählen Sie "Bohrung zur neuen durchschnittlichen Vertiefung hinzufügen". Benennen Sie es im Popup-Fenster; Machen Sie dasselbe für alle einzelnen Wells, die gruppiert werden sollen.
9. Überprüfen Sie alle durchschnittlichen Vertiefungen, um sicherzustellen, dass alle die gleichen Anfangsbedingungen vor der Co-Kultur haben. Wenn einige signifikant unterschiedliche absolute TEER-Werte oder TEER-Steigungen aufweisen oder die Standardfehler zu groß sind, wiederholen Sie die Gruppierung.
   HINWEIS: Die optimale Gruppierung der Vertiefungen ermöglicht eine minimale Variation der TEER-Werte innerhalb und zwischen experimentellen Gruppen.
10. Drücken Sie auf der Registerkarte "Experiment" auf "Pause", trennen Sie das Gerät und nehmen Sie es aus dem Inkubator. Entfernen Sie die Deckel unter der Laminar-Flow-Haube.
11. Bereiten Sie voraktivierte und/oder naive T-Zellen vor, mit oder ohne spezifische Zytokine, Antikörper oder andere Substanzen, wie gewünscht. Mischen Sie beispielsweise gereinigten nativen/niedrigen Endotoxin (NA/LE) Ratten-Anti-Maus-Interferon-gamma (IFN-γ)-Antikörper (Klon XGM1.2) mit vorbereiteten T-Zellen bei 20 μg/ml pro Vertiefung des TEER-Geräts.
    HINWEIS: Wenn Substanzen wie Granzym-B-Inhibitoren verwendet werden, werden sie zu Beginn der T-Zell-Stimulation der T-Zell-Kultur zugesetzt: z.B. , Granzym-B-Inhibitor II (Calbiochem) wird mit isolierten T-Zellen in einer Endkonzentration von 10 μM in Dimethylsulfoxid (DMSO) gemischt.
12. Entfernen Sie einen Teil des Mediums aus dem Einsatz (dem oberen Vertiefungsfach). Beispiel: 150 μl vorsichtig pipettieren (es sollte vermieden werden, das gesamte Medium zu entfernen, da dies die MBMEC-Monoschicht stören könnte).
13. Fügen Sie T-Zellen zu MBMECs hinzu, indem Sie vorsichtig 150 μl Medium pipettieren, das 2 x 10⁵ Zellen/Einsatz enthält.
    HINWEIS: Bei der Ernte von voraktivierten T-Zellen wird nur die Trypanblau-freie Zelle gesprengt.
14. Schließen Sie die Deckel und legen Sie das Instrument wieder in den Inkubator. Schließen Sie das Gerät wieder an und drücken Sie auf "Messung fortsetzen". Drücken Sie nach 24 Stunden auf der Registerkarte "Experiment" auf "Stopp" und speichern Sie die Datei (Datei>Speichern).

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
cellZscope	nanoAnalytics GmbH	www.nanoanalytics.com	einschließlich: 24-Well-Zellmodul, Controller, PC mit cellZscope Software v2.2.2
Transwell-Membraneinsätze - Porengröße 0,4 μm	Corning	3470	für die TEER-Messung als Hauptanzeige
Transwell-Membraneinsätze - Porengröße 3 μm	Corning	3472	für die TEER-Messung als Qualitätskontrolle vor dem T-Zell-Transmigrationsassay
24-Well-Zellkulturplatte	Greiner	650 180	flacher Boden; für MBMEC-Kultur
96-Well-Zellkulturplatte	Costar	3526	runder Boden; für Immunzellkultur
Neubauer-Zählkammer	Marienfeld	MF-0640010	für die Zellzählung
Kollagen Typ IV aus der menschlichen Plazenta	Sigma	C5533	für MBMEC-Beschichtungslösung
Fibronektin aus Rinderplasma	Sigma	F1141-5MG	für MBMEC-Beschichtungslösung
DMEM (+ GlutaMAX)	Gibco	31966-021	für MBMEC-Isolierung und MBMEC-Kulturmedium
Penicillin/Streptomycin	Sigma	P4333	für MBMEC-Isolierung und MBMEC-Kulturmedium
Heparin	Sigma	H3393	für MBMEC-Kulturmedium
Humaner basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF)	PeproTech	100-18B	für MBMEC-Kulturmedium
IMDM + 1% L-Glutamin	Gibco	21980-032	für T-Zell-Kulturmedium
Rekombinante Maus IFN-γ	PeproTech	315-05	für T-Zell-Transmigrationsassays
Rekombinante murine TNF-α	PeproTech	315-01A	für T-Zell-Transmigrationsassays
NA/LE gereinigter Anti-Maus-IFN-γ-Antikörper	BD Biowissenschaften	554408	Klon XMG1.2; Empfohlene Endkonzentration: 20 μg/ml
Granzym-B-Hemmer II	Calbiochem	368055	empfohlene Endkonzentration: 10 μM
PE-Anti-Maus-CD4-Antikörper	Biolegende	116005	Klon RM4-4; zur Analyse der T-Zell-Transmigration
Trypanblau-Lösung, 0,4%	Thermo Fisher Wissenschaftlich	15250061	für die Zellzählung