Alle Verfahren mit Tierproben wurden von der zuständigen tierethischen Überprüfungskommission überprüft und genehmigt.
1. Perfusion und Gewebeverarbeitung
- Anästhesieren Sie Mäuse durch eine intraperitoneale Injektion mit Ketamin (100 mg/kg) und Xylazin (10 mg/kg). Kneifen Sie die Zehen zusammen, um eine mangelnde Reaktion zu bestätigen, bevor Sie fortfahren.
- Transkardiale Perfusion mit ~50 mL eiskalter 0,1M Dulbecco's phosphatgepufferter Kochsalzlösung (DPBS), gefolgt von 4% Paraformaldehyd (PFA) in 0,1M Phosphatpuffer (PB).
ACHTUNG: PFA ist giftig. Verwenden Sie persönliche Schutzausrüstung (PSA), wenn Sie mit PFA arbeiten.
- Entfernen Sie das Gehirn und tauchen Sie es für 24 h in 4 % PFA in 0,1 M PB bei 4 °C für die Nachfixierung. Mit DPBS 3x waschen.
- Wechsel zu 15%iger Saccharoselösung in 0,1 DPBS über Nacht und dann zu 30%iger Saccharoselösung in 0,1 M DPBS für weitere 48 h bei 4 °C.
- Entfernen Sie das Gewebe aus der Saccharoselösung und frieren Sie es in einer auf -20 °C voreingestellten Kryotomkammer ein. Gefrorene Proben können bis zum Schneiden in verschlossenen Röhrchen bei -80 °C gelagert werden.
- Einbetten von Geweben in ein Einbettungsmedium mit optimaler Schnitttemperatur (siehe Materialtabelle) und montieren Sie es auf einer Probenscheibe. Schneiden Sie serielle 30 μm dicke Schnitte in einer koronalen Ebene mit einem Kryotom und sammeln Sie alle Schnitte anschließend in 24-Well-Kulturplatten, die mit Kryoprotektivlösung (30 % Glycerin, 30 % Ethylenglykol, 40 % DPBS; Abbildung 1A–C). Im Gefrierschrank bei -20 °C lagern.
HINWEIS: Dickere Abschnitte (z. B. 50 μm) sind vorzuziehen, wenn dies möglich ist. Stellen Sie sicher, dass die Abschnitte in Schnittreihenfolge gehalten werden und dass alle Abschnitte vollständig mit Kryoprotektivum gefüllt sind. Eine 96-Well-Platte kann als Alternative zu 24-Well-Platten verwendet werden, um Schnitte zu sammeln.
- Decken Sie die Vertiefungen mit Plattenversiegelung ab, um Verdunstung und Austrocknung zu verhindern. Teller bis zur weiteren Verwendung bei -20 °C lagern. Schnitte, die bei -20 °C gelagert wurden, sind für die Immunhistochemie der Cholinacetyltransferase (ChAT) mehrere Monate lang stabil.
2. Systematische Abschnittsauswahl für IHC
HINWEIS: Es sollte eine Pilotstudie durchgeführt werden, um die Gesamtzahl der Abschnitte zu ermitteln, die erforderlich sind, um einen akzeptablen Fehlerkoeffizienten (CE) zu erreichen. Der CE-Wert ist ein Ausdruck für die Gesamtfehlermenge im Probenahmeverfahren. Der niedrigste Wert stellt den minimalen Fehler dar, und ein CE-Wert kleiner als 0,1 wird von der hier verwendeten Software als akzeptabel angesehen (siehe Materialtabelle).
- Identifizieren Sie den ersten und letzten Abschnitt für jedes Gehirn, indem Sie morphologische Merkmale mit einem Standard-Maus-Gehirnatlas wie Franklin und Paxinos vergleichen. Der Nucleus basalis von Meynert oder NBM beginnt bei einem Bregma von -0,0 mm und endet bei -1,6 mm. Daher enthalten etwa 50 Abschnitte NBM. Die Gesamtzahl der Abschnitte ist einer der Parameter, die während der Stereologie benötigt werden. Die Auswahl jedes 8. Abschnitts (SSF = 1/8) ergab insgesamt 6–7 Schnitte für die Analyse und ergab in unserer Pilotstudie eine akzeptable CE sowohl für die Volumen- als auch für die Faserlängenschätzung
.
- Beginnen Sie nach dem Zufallsprinzip mit einem der ersten acht Abschnitte und beproben Sie dann systematisch jeden 8. Schnitt bis zum letzten hinteren Abschnitt, der NBM enthält (Abbildung 1C).
3. Immunhistochemie
- Übertragen Sie die kryokonservierten Schnitte auf Raumtemperatur in einem Kryoprotektivum und dann 0,1 M Phosphatpuffer (PB) in 6-Well-Platten.
- 3x in PB waschen.
- In 0,3 % H2O2 in Methanol 15 min inkubieren.
- 3x in Tris-gepufferter Kochsalzlösung (TBS) waschen.
- Inkubieren Sie in 0,25% Triton X-100 in TBS für 30 Minuten.
- Mit 10 % normalem Rinderserum (NBS) in 0,1 % Triton X-100 in TBS für 30 min blockieren.
- Inkubieren Sie mit einer Verdünnung von 1:1.000 Anti-Human-ChAT-Primärantikörpern (siehe Materialtabelle) in TBS mit 0,1 % Triton X-100 und 1 % NBS für 48 Stunden bei 4 °C.
- 3x in TBS bei Zimmertemperatur waschen. Führen Sie alle weiteren Inkubationen und Wäschen bei Raumtemperatur durch.
- Inkubieren Sie mit biotinyliertem Rinder-Anti-Ziegen-Sekundärantikörper (siehe Materialtabelle) für 1 h.
- 3x in TBS waschen.
- Inkubieren Sie mit dem Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplex (siehe Materialtabelle).
- 3x in TBS waschen.
- Entwickeln Sie mit einer verbesserten DAB-Peroxidase-Substratlösung (siehe Materialtabelle) gemäß den Empfehlungen des Herstellers.
ACHTUNG: DAB steht im Verdacht, krebserregend zu sein. Es ist giftig bei Kontakt und Einatmen. Verwenden Sie PSA, wenn Sie mit DAB arbeiten.
- Waschen Sie den Abschnitt ein paar Mal mit destilliertem Wasser und halten Sie ihn bei einem Tris-pH-Wert = 7,6.
- Montieren Sie die Abschnitte auf die gelatinierten Objektträger. Alle Schnitte eines Gewebes können auf denselben Objektträger gelegt werden. Trocknen Sie die Abschnitte an der Luft, dehydrieren Sie 2x für jeweils 5 min mit 70 %, 90 %, 95 % und 100 % Ethanol und reinigen Sie die Abschnitte dann mit zwei 10 min Xylol-Wäschen. Decken Sie die Abschnitte mit einem Eindeckmedium ab (siehe Materialtabelle).
HINWEIS: Die Verarbeitungszeit des Ausheizens und Räumens wirkt sich auf die Dicke der Schnitte aus. Daher sollten für alle Abschnitte die gleichen Bedingungen verwendet werden. In der aktuellen Studie lag der Mittelwert für die Enddicke bei 21,11 ± 0,45 μm.
- Bewahren Sie die Abschnitte zum Trocknen im Abzug auf. Die Trockenschnitte sind bereit für die Stereotechnik.
