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1. Synaptosomale Dopaminaufnahme
HINWEIS: Dieses Protokoll dient zur parallelen Beurteilung von zwei Gehirnen, kann aber auch erfolgreich verwendet werden, um Experimente zur synaptosomalen Dopaminaufnahme (DA) mit vier Gehirnen parallel durchzuführen.
- Vorbereitungen
- Markieren Sie 48 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen pro Tabelle 1 (24 für jedes Gehirn). Verwenden Sie unterschiedliche Farben für die Röhren, die zu jedem Gehirn gehören, um Verwechslungen zwischen den Proben zu vermeiden.
- Beschriften Sie 51 Szintillationsröhrchen #1-51.
- Legen Sie phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) auf Eis. Dies wird verwendet, um das Gehirn zu kühlen.
- Schalten Sie die Zentrifuge ein, um sie auf 4 °C vorkühlen zu lassen.
- Zwei Mikrozentrifugenröhrchen werden vorgewogen, um das genaue Gewebegewicht während der synaptosomalen Präparation zu ermitteln (Abschnitt 2.6).
- Bereiten Sie den Homogenisierungspuffer vor, indem Sie 4 mM HEPES und 0,32 M Saccharose mischen. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,4 ein und halten Sie ihn auf Eis.
HINWEIS: Homogenisierungspuffer kann in Aliquoten bei -20 °C aufbewahrt und am Tag des Versuchs aufgetaut werden.
- Bereiten Sie den Aufnahmepuffer vor, indem Sie Folgendes kombinieren: 25 mM HEPES, 120 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,2 mM CaCl2, 1,2 mM MgSO4, 1 mM Ascorbinsäure (0,194 g/L), 5 mM D-Glucose (0,991 g/L). Stellen Sie den pH-Wert mit NaOH auf 7,4 ein (führt zu einer Natriumkonzentration von ca. 130 mM) und halten Sie ihn auf Eis.
HINWEIS: Bereiten Sie für 2 Gehirne 1500 ml Aufnahmepuffer vor. Bereiten Sie den Aufnahmepuffer als 10-fache Stammlösung ohne Ascorbinsäure und Glukose bei 4 °C vor. Stellen Sie 1x Arbeitslösung am Tag frisch her und ergänzen Sie ihn mit Ascorbinsäure und Glukose. Stellen Sie den pH-Wert mit NaOH auf 7,4 ein.
- Bereiten Sie Aufnahmepuffer + Ligand vor, indem Sie Folgendes kombinieren: 25 mM HEPES, 120 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,2 mM CaCl2, 1,2 mM MgSO4, 1 mM Ascorbinsäure (0,194 g/L), 5 mM D-Glucose (0,991 g/L), 1 μM Pargylin, 100 nM Desipramin, 10 nM Catechol-O-Methyltransferase (COMT)-Hemmer. Stellen Sie sich mit NaOH auf einen pH-Wert von 7,4 ein und halten Sie es auf Eis.
HINWEIS: Verwenden Sie einen 50-ml-Aufnahmepuffer und fügen Sie einen Liganden hinzu. Pargylin wird hinzugefügt, um den Abbau von DA durch Oxidation durch Monoaminoxidase (MAO) zu verhindern. COMT-Inhibitor (RO-41-0960) wird hinzugefügt, um den Abbau von DA (Katecholamine im Allgemeinen) durch COMT zu verhindern. Desipramin wird hinzugefügt, um die Aufnahme durch die Noradrenalin- und Serotonintransporter zu hemmen und dadurch die Aufnahmeergebnisse spezifisch für den Dopamintransporter (DAT) zu machen.
- Bereiten Sie Aufnahmepuffer + Ligand + Kokain (CoC) vor, indem Sie Folgendes kombinieren: 25 mM HEPES, 120 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,2 mM CaCl2, 1,2 mM MgSO4, 1 mM Ascorbinsäure (0,194 g/L), 5 mM D-Glucose (0,991 g/L), 1 μM Pargylin, 100 nM Desipramin, 10 nM COMT-Inhibitor, 500 μM Kokain. Stellen Sie den pH-Wert mit NaOH auf 7,4 ein und halten Sie ihn auf Eis.
HINWEIS: Verwenden Sie 7 ml Aufnahmepuffer + Ligand und fügen Sie Kokain hinzu. Kokain wird hinzugefügt, um eine Hintergrundmessung der unspezifischen DA-Aufnahme zu erhalten, die von den Daten subtrahiert wird, so dass nur die DAT-spezifische Aufnahme übrig bleibt (da SERT und NET durch Desipramin gehemmt werden, wie oben beschrieben). Alternativ kann stattdessen ein hochwirksamer und spezifischer DAT-Inhibitor, GBR-12935, verwendet werden.
Wichtig: Halte ab sofort alles auf Eis.
- Synaptosomale Zubereitung
- Opfere eine Maus nach der anderen durch Gebärmutterhalsluxation und Enthauptung.
- Schneide die Haut mit einer Schere auf, um den Schädel freizulegen, und schneide überschüssiges Gewebe hinter dem Schädel ab, das von der Enthauptung übrig geblieben ist. Schneide den Schädel mit einer kleinen geraden Schere entlang der Sutura sagittalis und ende so weit vorne wie möglich.
- Platzieren Sie die beiden Scherenspitzen in jedem Auge der Maus und schneiden Sie durch den Schädel, um den Rest des Schädels und das intakte Gehirn zu entfernen. Entfernen Sie schnell das Gehirn und legen Sie es in eiskaltes PBS. Dadurch bleibt es kalt, während das zweite Gehirn präpariert wird.
- Präparieren Sie mit einer Hirnmatrix einen 3 mm großen koronalen Schnitt des Striatums (anterior-posterior: +1,5 mm bis -1,5 mm), gefolgt von einer feineren Dissektion mit einem Puncher. Siehe Abbildung 1 für den Stanzbereich.
- Halten Sie das Taschentuch immer auf Eis, um sich vorwärts zu bewegen.
- Übertragen Sie das Gewebe zum Wiegen in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
HINWEIS: Diese Gewichtung wird in Schritt 1.2.14 verwendet.
- Wiederholen Sie die Schritte 1.2.1-1.2.6 für das zweite Gehirn.
- Sobald das Gewicht für beide Gehirne ermittelt wurde, wird das Gewebe in ein Homogenisierungsglas mit 1 ml eiskaltem Homogenisierungspuffer übertragen.
- Homogenisieren Sie das Gewebe mit einem motorbetriebenen Stößel bei 800 U/min, 10 gleichmäßige Hübe.
HINWEIS: Ein Schlag entspricht einer Auf- und Abbewegung. Der erste Schlag sollte ca. 5 s dauern, die folgenden 3-4 s. Die Homogenisierung in isotonischem Medium ist wichtig, um ein Platzen der Synaptosomen zu verhindern. Durch die Verwendung geeigneter Kraft und isotonischen Mediums können die präsynaptischen Endungen wieder verschlossen werden, die das Zytoplasma, die synaptischen Vesikel, die Mitochondrien und das Zytoskelett umschließen.
- Übertragen Sie das Homogenat in ein 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen und sammeln Sie das restliche Homogenat aus dem Homogenisierungsglas, indem Sie es mit 0,5 mL zusätzlichem Homogenisierungspuffer spülen.
- Bewahren Sie die Probe auf Eis auf, während das Gewebe aus dem anderen Gehirn homogenisiert wird. Führen Sie die beiden Gehirne in den Schritten 1.2.12-1.2.13 parallel aus.
- Pelletieren Sie die Zellkerne und Zelltrümmer durch Zentrifugation (1.000 x g, 10 min, 4 °C).
- Den Überstand (S1) (der Zellmembranen und Zytoplasma enthält) in neue 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen überführen und bei 16.000 x g für 20 min bei 4 °C zentrifugieren.
- Der Überstand (mit Zytoplasma) wird verworfen und das Pellet (P2) (mit rohen Synaptosomen) in 40 μl Homogenisierungspuffer/mg-Gewebe (basierend auf dem in Schritt 1.2.6 ermittelten Gewicht) resuspendiert. Resuspendieren Sie die rohe synaptosomale Fraktion vorsichtig mit einer p1000-Pipette, da zu viel Kraft die Synaptosomen bricht.
HINWEIS: Es ist wichtig, mindestens 280 μL zu haben. Ist dies nicht der Fall, ist eine Verdünnung mit mehr als 40 μl pro mg erforderlich. Die Schritte 1.2.1-1.2.13 müssen so schnell wie möglich durchgeführt werden, und alles muss auf Eis gelegt werden. Sobald die rohen Synaptosomen in Homogenisierungspuffer resuspendiert wurden, sind sie einigermaßen stabil, solange sie auf Eis gehalten werden.
2. Aufnahme-Experiment
- Geben Sie 440 μl Aufnahmepuffer + Ligand + Kokain in die dafür vorgesehenen 12 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und 440 μl Aufnahmepuffer + Ligand in die 36 verbleibenden 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen (siehe Tabelle 1 für das Layout).
HINWEIS: Nehmen Sie sie 15 Minuten vor Beginn des Experiments aus dem Eis, um sie auf Raumtemperatur zu bringen, aber lassen Sie sie bis dahin auf Eis, um Inhibitoren zu sparen.
- Sättigungskurve erstellen (Dopamin (2, 5, 6-[3H]-DA) (3-H Dopamin) (91,1 Ci/mmol) in verschiedenen Endkonzentrationen (0,031, 0,0625, 0,125, 0,25, 0,5 und 1,0 μM)).
- Beschriften Sie sechs 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit 10, 5, 2,5, 1,25, 0,62 und 0,31.
- Geben Sie 750 μl Aufnahmepuffer + Ligand in die 5 Mikrozentrifugenröhrchen mit der niedrigsten Anzahl.
- Geben Sie 1.455,4 μl Aufnahmepuffer + Ligand, 14,6 μl Dopamin (1 mM) und 30 μl 3-H Dopamin (11 μM) in das mit 10 gekennzeichnete Röhrchen.
- Übertragen Sie 750 μl aus dem Röhrchen mit der Bezeichnung 10 in das Röhrchen mit der Bezeichnung 5. Gut mischen und 750 μl aus diesem Röhrchen in das 2,5-Röhrchen übertragen. Wiederholen Sie diese Verdünnung mit den restlichen Röhrchen.
- Spülen Sie die Mikrofaserfilter aus Glas mit 4 ml Aufnahmepuffer vor, nachdem Sie sie auf einen 12-Well-Filtereimer gelegt haben.
- Geben Sie 10 μl der synaptosomalen Membransuspension in die ersten 24 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen (siehe Tabelle 1 für das Layout) mit 440 μl Puffer. Vorsichtig vortexen und kurz herunterdrehen, um sicherzustellen, dass die Synaptosomen in den Puffer eingetaucht sind. Bei 37 oC 10 Min. gehen lassen
HINWEIS: Es ist wichtig, die Zeiten während des Aufnahmeexperiments genau zu bestimmen, um einen fairen Vergleich zwischen den Gehirnen zu ermöglichen. Verwenden Sie eine Stoppuhr für Präzision.
- 50 μl Dopamin in Konzentrationen 10 und 5 μM (Abschnitt 2.2) werden in die ersten beiden Spalten gegeben und bei 37 oC 5 Minuten lang unter Schütteln belassen. Stoppen Sie die Reaktion nach genau 5 Minuten, indem Sie 1 ml eiskalten Aufnahmepuffer hinzufügen. Dasselbe ist mit den Konzentrationen 2,5 und 1,25 μM (Abschnitt 2.2) und dann mit den Konzentrationen 0,62 und 0,31 μM zu tun.
- Geben Sie die Proben in die vorgespülten Mikrofaserfilter und waschen Sie sie mit 5 x 4 mL eiskaltem Aufnahmepuffer. Wenn die ersten 12 Proben zu den Filtern hinzugefügt wurden, bewegen Sie die Filter in Szintillationsröhrchen. Wiederholen Sie dies mit den nächsten 12 Proben.
- Wiederholen Sie die Schritte 2.4-2.6 für das nächste Gehirn.
- Bereiten Sie 3 Röhrchen mit maximaler Zählung vor, indem Sie einen Mikrofaserfilter in den Boden der Szintillationsröhrchen 49-51 einsetzen und 25 μl der maximalen Dopaminkonzentration (10 μM) hinzufügen.
- Lassen Sie alle 51 Szintillationsröhren 1 h lang in einem Abzug.
- Geben Sie 3 mL Szintillationsflüssigkeit in jedes Szintillationsröhrchen und schütteln Sie es 1 h lang kräftig auf einem Shaker.
- Zählen Sie [3H]-DA in einem Beta-Zähler für 1 Minute.
- Öffnen Sie das Programm und wählen Sie: Etikett: H-3, Platte/Filter: 4 mL Fläschchen, 4 x 6, Assay-Typ: Normal und Zählzeit: 1 min.
HINWEIS: Dieser Schritt kann am nächsten Tag durchgeführt werden, wenn es bequemer ist. Lassen Sie die Proben über Nacht mit Alufolie abdecken.
- Protein-Bestimmung
- Verwenden Sie ein Standard-BCA-Protein-Assay-Kit, um die Proteinkonzentrationen der Synaptosomen zu bestimmen, für Anpassungen von Zählungen pro min (cpm) auf fmol/min/μg und für einen korrekten Vergleich der Aufnahme zwischen Proben.
3. Datenanalyse
- Verwenden Sie die Daten aus dem Aufnahmeexperiment, um eine Sättigungskurve für jede Gruppe zu erstellen und die Reaktionsgeschwindigkeit (Vmax) und die Michaelis-Menten-Konstante (KM) zu berechnen.
HINWEIS: Der KM-Wert spiegelt die Substratkonzentration wider, die erforderlich ist, um die Hälfte von Vmax zu erreichen. Dementsprechend spiegelt Vmax direkt die Funktion von DAT (maximale Aufnahmekapazität) wider, die von der Anzahl der DAT auf der Oberfläche abhängt und davon, wie ihre Aktivität durch posttranslationale Modifikationen und/oder interagierende Proteine sowie durch Veränderungen in den Ionengradienten moduliert werden kann. Der KM -Wert ist ein indirektes Maß für die Substrataffinität für den Transporter, der vor allem auch durch posttranslationale Modifikationen und/oder interagierende Proteine moduliert werden kann. Um funktionelle Veränderungen vollständig beurteilen zu können, ist es daher wichtig, die Oberflächenexpressionsniveaus direkt zu bestimmen, z. B. durch einen Oberflächenbiotinylierungsassay.
Tabelle 1: Anordnung der Mikrozentrifugenröhrchen für die synaptosomale Präparation.
| 10 | 5 | 2,5 | 1,25 | 0.62 | 0.31 |
| 10 | 5 | 2,5 | 1,25 | 0.62 | 0,31 |
| 10 | 5 | 2,5 | 1,25 | 0,62 | 0.31 |
| 10+coc | 5+coc | 2.5+coc | 1.25+coc | 0.62+coc | 0.31+coc |
