Markierung von Biocytin-gefüllten Interneuronen in Hippocampusschnitten von Ratten zur Visualisierung

Zusammenfassung

Quelle: Economides, G., et al. Biocytin-Rückgewinnung und 3D-Rekonstruktionen von gefüllten hippokampalen CA2-Interneuronen. J. Vis. exp. (2018)

Dieses Video zeigt das Verfahren zum Färben von fixierten Rattenhirnschnitten, die Biocytin-gefüllte Interneurone enthalten. Das Protokoll umfasst die Inkubation mit dem Avidin-Biotin-Komplex (ABC), die Färbung mit HRP und chromogenem Substrat, die Konservierung der Strukturen mit Osmiumtetroxid und die Einbettung des Gewebes in Harz für die Bildgebung.

Protokoll

Alle Verfahren mit Tierproben wurden von der zuständigen Ethikkommission für Tiere überprüft und genehmigt

1. Bestimmung des Calcium-bindenden Proteins bzw. Proteingehalts von Interneuronen und Biocytin-Visualisierung nach elektrophysiologischen Ableitungen und Biocytin-Füllung

Hinweis: Am Ende der elektrophysiologischen Aufzeichnungen werden Schnitte, die mit Biocytin gefüllte Zellen enthalten, über Nacht fixiert, bevor histologische Eingriffe durchgeführt werden. Die Fixierlösung wird am nächsten Morgen durch einen einmaligen Wechsel von 0,1 M Phosphatpuffer ersetzt, wenn der Rest des Eingriffs an einem anderen Tag durchgeführt wird, um Gewebeschäden zu vermeiden. Die Fixierlösung (4 % Paraformaldehyd, 0,2 % gesättigte Pikrinsäurelösung, 0,025 % Glutaraldehydlösung in 0,1 M Phosphatpuffer (PB)) muss am Tag der Aufnahme frisch gemacht werden, um optimale Ergebnisse zu erzielen.

1. Am Ende der elektrophysiologischen Aufzeichnung wird die Scheibe mit der aufgenommenen Zelle(n) vorsichtig mit einem Pinsel aufgenommen und in einen Topf mit künstlicher Hirnmarksflüssigkeit (ACSF) gelegt.
   Anmerkung: Einzelheiten des Protokolls, das für die Schnittvorbereitung und intrazelluläre Aufzeichnungen mit scharfen Elektroden verwendet wird, wurden bereits beschrieben.
2. In einem Abzug die Gehirnscheibe vorsichtig mit einem Pinsel aufnehmen und auf ein kleines Stück feines Filterpapier rollen. Legen Sie ein weiteres Stück angefeuchtetes Filterpapier auf die Scheibe und legen Sie die beiden Stücke nasses Filterpapier in einen kleinen Plastiktopf mit 5-10 mL Fixierlösung und lagern Sie sie über Nacht bei 4 °C im Kühlschrank.
3. Bereiten Sie eine Lösung aus Gelatine in destilliertem Wasser vor. Geben Sie 20 ml destilliertes Wasser in ein Becherglas auf einer heißen Platte und erhitzen Sie es auf 60 °C. Geben Sie nach und nach 2,4 g Gelatine in das Wasser, warten Sie, bis es sich aufgelöst hat, und lassen Sie es vor Gebrauch auf 35–40 °C abkühlen, um Gewebeschäden zu vermeiden.
4. Ersetzen Sie die Fixierlösung durch 2 mL mit 0,1 M PB. Legen Sie die Scheibe in eine Petrischale und schneiden Sie überschüssiges Gewebe mit einer Skalpellklinge ab. Legen Sie das abgeschnittene Gewebe in eine Petrischale (Durchmesser 9 cm, Höhe 1,4 cm), achten Sie darauf, dass es flach und ohne Falten oder Falten aufliegt, und entfernen Sie den überschüssigen Puffer mit einem trockenen Pinsel.
5. Bedecken Sie das Taschentuch mit der warmen Gelatinelösung und stellen Sie die Petrischale auf einen gefrorenen Block, um die Lösung schnell abzukühlen.
6. Schauen Sie mit einer Winkellampe, um Kontrast zu erzeugen, durch die Seite der Schale und halten Sie die Scheibe mit leichtem Druck eines feinen Pinsels flach, bis die Gelatine zu fest wird.
   Anmerkung: Die Gelatine kann wieder geschmolzen werden, wenn das Gewebe nicht flach aufliegt. Unvollkommenheiten auf der Oberfläche der Gelatine, die durch das Entfernen des Pinsels beim Erstarren verursacht werden, können durch sanftes Schmelzen der Oberflächenschicht entfernt werden, indem der Kolben der Lampe einige Sekunden lang nahe an die Oberfläche bewegt wird.
7. Die Schüssel mit der festen Gelatine in den Kühlschrank stellen und bei 4 °C 30-60 min ziehen lassen.
8. Schneiden Sie in einem Abzug mit einer Skalpellklinge einen kleinen Block (~ 1 x 1 cm) aus, der das in Gelatine eingebettete Gewebe der Schale enthält, heben Sie den Block mit einem kleinen Spatel an und legen Sie ihn vorsichtig mindestens 30 Minuten lang bei 4 °C in die gleiche, aber frische Fixierlösung, mit der die Scheiben fixiert wurden.
9. Waschen Sie den Gelatineblock dreimal in 5 mL mit 0,1 M PB, trocknen Sie ihn mit einem Stück Papiertuch ab und kleben Sie die Blockseite nach oben (d. h. mit dem Taschentuch nach oben) mit Sekundenkleber auf ein Vibrationsfutter.
10. Entfernen Sie überschüssigen Kleber mit einem Stück Filterpapier und schneiden Sie mit einer Skalpellklinge die Ecken des Blocks ab, so dass eine Rautenform entsteht.
11. Die Scheibe wird mit einem Vibratom bei einer Dicke von 50 μm geschnitten und jedes Stück vorsichtig in ein Glasfläschchen mit 10 % Saccharose gelegt.
12. Nehmen Sie vorsichtig einen Teil aus dem Fläschchen und legen Sie ihn flach in einen Deckel der Petrischale. Entfernen Sie mit einem Präpariermikroskop und einer frischen Skalpellklinge die Gelatine um den Schnitt herum und geben Sie den Schnitt wieder in ein Fläschchen mit 2 ml frischer 10%iger Saccharose
    Anmerkung: In dieser Phase ist es wichtig, so viel Gelatine wie möglich zu entfernen, um die Gewebeschrumpfung während des Dehydratisierungsschritts (Schritt 1.37) zu reduzieren.
13. Kryoschützen Sie die Schnitte in 0,1 M PB-basierter Saccharose-Glycerin-Lösung bei Raumtemperatur, indem Sie sie 10 Minuten lang in 10%iger Saccharoselösung, zweimal 20 min in 20%iger Saccharose-6%iger Glycerinlösung und schließlich zweimal 30 Minuten in 30%iger Saccharose-12%iger Glycerinlösung unter ständigem Rühren inkubieren.
14. Lege die Abschnitte mit einem Pinsel flach auf ein kleines Rechteck aus Alufolie. Entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit von den Abschnitten und falten Sie die Alufolie vorsichtig zu einem Päckchen.
15. Halten Sie das Paket 30 s lang nahe an die Oberfläche des flüssigen Stickstoffs, ohne die Oberfläche zu berühren, und lassen Sie die Abschnitte dann etwa 30 s lang vollständig auftauen. Wiederholen Sie das Einfrieren und Auftauen noch zweimal.
16. Entfernen Sie alle Teile mit einem Pinsel und legen Sie sie unter ständigem Rühren in ein Glasfläschchen mit 2 ml 0,1 M PB, um überschüssige Saccharose abzuwaschen.
17. Entfernen Sie das PB mit einer Pasteurpipette und inkubieren Sie die Schnitte in 2 mL 1% wässrigem Wasserstoffperoxid (H₂O₂) für 30 min. Waschen Sie die Schnitte in 2 mL von 0,1 M PB 3x 5 min.
18. Entfernen Sie die 0,1 M PB mit einer Pasteurpipette und geben Sie 1 % Natriumborhydrid (NaBH₄) in 0,1 M PB.
    Anmerkung: Verschließen Sie das Fläschchen nicht, da die NaBH_4-Lösung Wasserstoffgas abgibt.
19. Entfernen Sie das Natriumborhydrid mit einer Pasteur-Pipette und waschen Sie die Schnitte gründlich in 2 mL von 0,1 M PB 5x 5 min.
20. Ersetzen Sie die 0,1 M PB durch 10% normales Ziegenserum (NGS) in 0,1 M PB für 30 min.
21. Das Ziegenserum wird entnommen und die Schnitte über Nacht bei 4 °C in einer Mischung aus monoklonalen Antikörpern der Maus und der polyklonalen Kaninchenantikörper in ABC-Lösung inkubiert.
    Anmerkung: Eine Liste der primären Antikörper, die in früheren Studien verwendet wurden, ist in Tabelle 1 dargestellt.
22. Inkubieren Sie die Schnitte für 2 h im Dunkeln in einer Mischung aus fluoreszenzmarkierten Sekundärantikörpern (Table of Materials).
23. Montieren Sie die Abschnitte auf die Dias mit Montagemedium und decken Sie sie mit einem Deckglas ab.
24. Nehmen Sie Bilder der Fluoreszenzmarkierung bei 40-facher Vergrößerung auf (Abbildung 1Bb).
25. Legen Sie den Objektträger nach der Fluoreszenzbildgebung in eine Glas-Petrischale, die PBS enthält, und entfernen Sie vorsichtig das Deckglas. Waschen Sie dann die Abschnitte mit sanften Impulsen von PBS aus einer Pasteur-Pipette vom Objektträger ab. Legen Sie die Schnitte in ein sauberes Glasfläschchen, das PBS enthält.
26. Führen Sie die Avidin-HRP-Reaktion durch, indem Sie zunächst die Abschnitte in ABC mindestens 2 h lang inkubieren, um das HRP-Reaktionsprodukt zu amplifizieren.
27. Bereiten Sie die 3,5-Diaminobenzidin (DAB)-Lösung vor, indem Sie eine Tablette in 5 ml destilliertes Wasser geben.
28. Waschen Sie die Abschnitte dreimal 10 min lang mit PBS und anschließend zweimal 10 min lang mit Tris-Puffer. Entfernen Sie den Tris-Puffer nach dem letzten Waschen.
29. Geben Sie schnell einen Tropfen 8 %ige NiCl₂ (Nickelchlorid)-Lösung in die DAB-Lösung, pipettieren Sie die Lösung zum Mischen ein und aus und geben Sie schnell 1 ml dieser Lösung über die Schnitte. Inkubieren Sie die Schnitte 15 Minuten lang in der DAB/NiCl_2-Lösung.
30. 10 μl 1 % H₂O₂ zur DAB-Lösung geben. Lassen Sie die Reaktion im Dunkeln unter ständigem Rühren etwa 1 bis 2 Minuten ablaufen und überwachen Sie die Markierung der gefüllten Zellen mit einem Präpariermikroskop.
31. Stoppen Sie die Reaktion, indem Sie die DAB/NiCl₂/H₂O_2-Lösung entfernen und die Abschnitte zweimal 5 Minuten lang mit Tris-Puffer waschen.
32. Legen Sie in einen Abzug einen kleinen Kreis Filterpapier in eine Petrischale und befeuchten Sie diesen mit 0,1 M PB. Heben Sie die Teile nacheinander mit einem Pinsel aus dem Glasfläschchen und legen Sie sie vorsichtig flach auf das Papier.
33. Decken Sie die Abschnitte mit einem weiteren angefeuchteten Kreis Filterpapier ab und entfernen Sie überschüssigen Puffer, indem Sie das Seidenpapier vorsichtig mit der Oberfläche berühren.
34. Tragen Sie 8–9 Tropfen 1 % Osmiumtetroxid in 0,1 M PB auf das obere Papier auf, decken Sie die Schale ab und lassen Sie es mindestens 30 min, jedoch nicht länger als 1 h im Abzug.
35. Öffnen Sie die Petrischale und heben Sie das obere Filterpapier an. Heben Sie die Abschnitte vorsichtig nacheinander mit einem Pinsel an, legen Sie sie in ein Glasfläschchen und spülen Sie sie zweimal in destilliertem Wasser ab.
36. Osmiumtetroxid-Abfälle sind ordnungsgemäß zu entsorgen. Spülen Sie alle Einweggeräte aus und legen Sie sie in geeignete Behälter.
37. Legen Sie jeden Abschnitt flach auf einen Glasschieber und decken Sie die Abschnitte ab. Übertragen Sie den Objektträger in eine Petrischale, stellen Sie ein leeres Glasfläschchen über das Deckglas, um es an Ort und Stelle zu halten, und bedecken Sie es mit 50% Alkohol. Entfernen Sie nach 15 Minuten den Objektträger aus der Lösung und entfernen Sie die Abschnitte vom Objektträger. Legen Sie die Abschnitte wieder auf die Folie und legen Sie die Folie dann 15 Minuten lang in 70%igen Alkohol. Wiederholen Sie den gleichen Vorgang mit 95% und schließlich 100% iger Alkohollösung.
38. Nach dem Dehydratisierungsschritt werden die Abschnitte in ein Glasfläschchen mit 100 % Alkohol auf einem Shaker in einem Abzug umgefüllt. Die Alkohollösung durch Propylenoxid (C₃H₆O) ersetzen und dreimal 5 Minuten lang waschen. Bewahren Sie nach dem letzten Waschen ~2 ml Propylenoxid in der Durchstechflasche auf und fügen Sie Harz (Verhältnis 1:1) hinzu. Stellen Sie sicher, dass sich das Harz auflöst und halten Sie die Abschnitte 30 Minuten lang unter ständigem Rühren.
39. Jedes Stück mit einem Holzstäbchen in eine mit Epoxidharz enthaltende Aluminium-Planchette legen und über Nacht inkubieren.
    HINWEIS: Lassen Sie die Abschnitte nicht länger als 24 Stunden im Harz, um das Risiko einer Beschädigung der Abschnitte zu vermeiden.
40. Die Planchette ca. 10 Min. auf eine Herdplatte legen. Jedes Stück mit einem Holzstäbchen aufnehmen und auf eine saubere Rutsche legen. Halten Sie die Ausrichtung jedes Abschnitts mit einem Präpariermikroskop konsistent. Legen Sie ein Deckglas über die Abschnitte. Legen Sie den Objektträger zum Aushärten für 48 h bei 56 °C in den Ofen.

Tabelle 1: Tabelle der Lösungen.

Eingesetzte Lösungen	Zusammensetzung/Anleitung
Lösung zur Fixierung	4 % Paraformaldehyd, 0,2 % gesättigte Pikrinsäurelösung, 0,025 % Glutaraldehydlösung in 0,1 M Phosphatpuffer (PB)
0,1 M Phosphatpuffer pH 7,6	100 mL Brühe 1 M Phosphatpuffer zu 900 mL destilliertem Wasser geben
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) pH 7,4/7,5	Fügen Sie 10 ml 0,1 M Phosphatpuffer, 0,2 g KCl und 8,76 g NaCl zu 990 ml destilliertem Wasser hinzu
TRIS Puffer pH 7,5	5,72 g Trishydrochlorid und 1,66 g Trisbase in 50 ml destilliertem Wasser auflösen. Dann mit destilliertem Wasser auf 1 L auffüllen.
Gepufferte Glutaraldehyd- und Paraformaldehyd-Fixierlösung	4 % Paraformaldehyd, 0,2 % gesättigte Pikrinsäurelösung, 0,025 % Glutaraldehydlösung in 0,1 M Phosphatpuffer.
ABC-Lösung	Lösung, die mindestens 30 Minuten vor der Verwendung aus dem ABC-Kit hergestellt werden muss. Fügen Sie 1 Tropfen Lösung A und 1 Tropfen Lösung B zu 2,5 ml PBS hinzu.
Durcupan Epoxidharz:	Für 20 Töpfe: 20 g der Komponente A, 20 g der Komponente B, 0,6 g der Komponente C und 0,4 g der Komponente D-
	Schützen Sie die Waage vor Verschütten, indem Sie die Platte mit einem Kreis aus Filterpapier abdecken. Wiegen Sie die Reagenzien vorsichtig in einem Tripour-Becherglas in den oben angegebenen Proportionen. Unter kräftigem Rühren mit zwei Holzstäbchen mindestens 5 Min. gründlich mischen. Die Mischung sollte eine dunkelbraune Farbe mit einheitlicher Dichte annehmen. Stellen Sie den Becher für maximal 10 min bei ~50 °C in den Ofen, um so viele Luftblasen wie möglich zu entfernen. Anmerkung: Das Harz beginnt auszuhärten, wenn Du den Becher länger als 10 Minuten im Ofen lässt. Gib das Harz in Plastiktöpfe oder 5-ml-Spritzen um, datiere sie und bewahre sie gebrauchsfertig im -20 °C-Gefrierschrank auf.

Ergebnisse

Abbildung 1: Neuronale Rekonstruktionen von zwei Arten von Korbzellen, die in der hippokampalen CA2-Region aufgezeichnet und gefüllt wurden, und korrelierte elektrophysiologische Daten, die nach intrazellulären Aufzeichnungen in vitro erhalten wurden. Diese Zahl wurde gegenüber früheren Studien modifiziert. SO Stratum Oriens, SP Stratum Pyramidale, SR Stratum Radiatum, SLM S...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Avidin-7-amino-4-methylcumarin-3-essigsäure (Avidin-AMCA) Antikörper - 20,8 mg/ml	Vektor-Laboratorien	A2008
Biocytin ≥98% (TLC)	Sigma	B4261
3,5 Diaminobenzidin (DAB) Tablette, Zur Zubereitung von 5 mL	Sigma	D4293
Durcupan Epoxidharz A	Sigma	44611
Durcupan Epoxidharz B	Sigma	44612
Durcupan Epoxidharz C	Sigma	44613
Durcupan Epoxidharz D	Sigma	44614
Ethanol, puriss. p.a., absolut, ≥99,8%	Sigma	32221
Gelatine	Sigma	48723
Glutaraldehydlösung, Klasse I, 25 % in H2O	Sigma	G5882
Glycerin, ≥99%	Sigma	G5516
Ziegenserum	Sigma	G9023
Ziegen-Anti-Maus-Fluorescein-Isothiocyanat (FITC)- 14,3 mg/ml	Sigma	F2653
Ziegen-Anti-Kaninchen Texas Red (TR)- 3,3 mg/ml	Invitrogen	T2767
Wasserstoffperoxid, 30%ige Lösung	Sigma	H-1009
Immersionsöl, Viskosität 1.250 cSt (lit.)	Sigma	I0890
Nickelchlorid	Sigma	N5756
Osmiumtetroxid, für die Elektronenmikroskopie, 4% in Wasser	Sigma	75632
Paraformaldehyd, Reagenzqualität, kristallin	Sigma	P6148
Pikrinsäure, mit Wasser angefeuchtet, ≥98%	Sigma	197378
Phosphatpuffer 1 M	Sigma	P3619
Propylenoxid, 99%	Alfa Aesar	30765
Natriumtetrahydroborat	VWR	27885.134
Saccharose	Fischer wissenschaftlich	S/8600/53
Trizma-Hydrochlorid, ≥99,0%	Sigma	T5941
Trizma-Basis, ≥99,9%	Sigma	T6066
Vectashield Antifade Eindeckmedium, Brechungsindex 1,45	Vektor-Laboratorien	H-1000
Vectastain Elite ABC HRP Bausatz	Vektor-Laboratorien	PK6100
Verwendete Ausrüstung
Vibratom	Agar Wissenschaftlich
C4A Planchetten aus gewölbtem Aluminium	GA-MA & ASSOCIATES, INC.
Leica DMR-Mikroskop	Leica Mikrosysteme
X-Cite 120PC Q Fluoreszenzlichtquelle	Excelitas Technologien
Leica DFC450 digitale Mikroskopkamera	Leica Mikrosysteme
Rapidograph Technischer Zeichenstift 0,18 mm	Grafikzentrum London
0,18 mm Rapidograph-Feder	Londoner Grafikzentrum
Rapidograph Technischer Zeichenstift 0,25mm	Londoner Grafikzentrum
0,25 mm Rapidograph-Feder	Londoner Grafikzentrum
Neurolucida-System mit PC-Arbeitsplatz, Bühne, Kamera und Joystic für die XYZ-Bühnensteuerung	Mikrobrighfield (MBF) Biowissenschaften
Neurolucida Softwareversion 2017	Mikrobrighfield (MBF) Biowissenschaften
CorelDRAW Grafiksuite X5	Corel
Videobearbeitungssoftware	Adobe Premiere Pro
Glasfläschchen 14 mL	Fischer wissenschaftlich