Bewertung der motorischen Beeinträchtigung in C. elegans-Modellen mit dem Radial Locomotion Assay

Zusammenfassung

Quelle: Currey, H. N., et al. Bewertung der motorischen Beeinträchtigung in C. elegans Modellen der Amyotrophen Lateralsklerose. J. Vis. exp. (2021).

Dieses Video zeigt die Verwendung eines radialen Lokomotionsassays zur Bewertung der motorischen Dysfunktion in C. elegans, die entweder Wildtyp- oder ALS-mutiertes humanes TDP-43-Protein exprimieren. Würmer mit unterschiedlicher Wildtyp- oder mutierter TDP-43-Expression werden kriechen gelassen, und ihre Bewegung wird anhand der radialen Strecke gemessen, die vom zentralen Punkt auf der Assay-Platte zurückgelegt wird. Der Assay unterscheidet zwischen leichten, mittelschweren und schweren motorischen Beeinträchtigungen, basierend auf der Strecke, die die verschiedenen C. elegans Stämme zurückgelegt haben.

Protokoll

1. Radialer Fortbewegungstest

1. Bereiten Sie Petrischalen mit einem Durchmesser von 100 mm oder 150 mm vor, die etwa zur Hälfte mit Nematodenwachstumsmedien (NGM) gefüllt und mit einem gleichmäßigen Rasen von OP50-Bakterien besät sind, um die gesamte Oberfläche des Agars zu bedecken.
2. Drehen Sie die NGM-Assay-Platten auf den Kopf und beschriften Sie den Boden mit einer Kennung für die zu testenden C. elegans -Stämme, 2 Platten pro Stamm (Abbildung 1A).
3. Machen Sie mit dem Marker einen kleinen Punkt in der Mitte der umgedrehten Platte (Abbildung 1A).
4. Während Sie mit einem Präpariermikroskop arbeiten, übertragen Sie 15-20 aufeinander abgestimmte Würmer mit einem Platindraht-Plektrum direkt über dem mittleren Punkt (sichtbar durch das NGM) in die Mitte der Assay-Platte (Abbildung 1B).
   HINWEIS: Versuchen Sie, alle Würmer gleichzeitig oder so schnell wie möglich zu übertragen.
   1. Stellen Sie einen Timer auf 30 Minuten, nachdem die Würmer in der Mitte der Platte platziert wurden. Setzen Sie den Deckel wieder auf die Platte und legen Sie ihn beiseite (Abbildung 1C).
5. Fahren Sie mit der Übertragung der Würmer fort, bis sich alle Stämme auf den dafür vorgesehenen Testplatten befinden, und notieren Sie sich, wie lange der Transfer zwischen den Platten ungefähr dauert (streben Sie ~ 1 Minute zwischen den Platten an). Halten Sie alle Platten in der gleichen Reihenfolge, in der sie aufgestellt wurden.
6. Beginnen Sie nach 30 Minuten mit dem Einritzen der ersten Platte.
   1. Nehmen Sie den Deckel ab und legen Sie die Platte mit der Vorderseite nach unten unter das Präpariermikroskop, so dass die beschriftete Rückseite der Platte nach oben zeigt und sich der NGM-Agar zwischen der Sichtlinie und den Würmern befindet. Die Platte steht bei normalem Gebrauch auf dem Kopf.
   2. Stellen Sie den Mikroskopfokus so lange ein, bis Würmer durch den Agar sichtbar sind.
   3. Setzen Sie mit einem andersfarbigen Filzstift vom Mittelpunkt aus einen kleinen Punkt an die Stelle jedes Wurms - folgen Sie den Wurmspuren durch den Bakterienrasen, um die am weitesten entfernten Tiere zu finden.
   4. Überprüfe den Rand der Platte, da dort einige Würmer landen können. Zählen und notieren Sie auch die Anzahl der Würmer im Mittelpunkt (Abbildung 1D).
7. Markieren Sie alle Assay-Platten in der richtigen Reihenfolge, so dass alle Platten eine Aktivitätszeit von 30 Minuten haben, und achten Sie darauf, die Zeit zu berücksichtigen, die zum Einrichten der Platte benötigt wurde. Führen Sie dann manuelle oder digitale Messungen durch, wie in den Schritten 1.8 oder 1.9 beschrieben.
8. Führen Sie manuelle Messungen mit einem Lineal durch.
   1. Verwenden Sie ein Lineal, um den Abstand vom Mittelpunkt bis zu den endgültigen Positionsmarkierungen für jeden Wurm in mm zu messen und den Abstand aufzuzeichnen. Um den Fortschritt während der Wertung im Auge zu behalten, beschriften Sie den ersten erzielten Punkt mit einer kleinen Markierungslinie.
   2. Zeichnen Sie die Längendaten für jeden Punkt nacheinander auf, indem Sie die Platte im Uhrzeigersinn drehen (Abbildung 1E).
9. Führen Sie digitale Messungen mit einem Scanner und ImageJ durch.
   1. Scannen Sie mit einem Flachbettscanner die Rückseite der Assay-Platte(n) neben einem Lineal (Zahlen zeigen zur Scanoberfläche) (Abbildung 2A).
   2. Öffnen Sie das gescannte Plattenbild in ImageJ oder einem ähnlichen Programm.
      HINWEIS: ImageJ ist eine kostenlose Java-basierte Bildverarbeitungssoftware, die von den NIH gehostet wird.
   3. Klicken Sie auf das Geradlinige Werkzeug und zeichnen Sie dann eine Linie, die die 1 cm und 2 cm Punkte auf dem gescannten Bild des Lineals verbindet (Abbildung 2B).
      HINWEIS: Wenn Sie die Umschalttaste gedrückt halten, wird die Linie auf den nächsten 45°-Winkel gedrückt.
   4. Navigieren Sie zum Menü Analysieren und verwenden Sie es, um die Skala einzustellen (Analysieren | Set-Skala) (Abbildung 2C).
   5. Geben Sie die Bekannte Entfernung (10) und Längeneinheiten (mm) in die entsprechenden Felder ein, passen Sie die Entfernung nicht in Pixelzahl an. Aktivieren Sie Global , um die gleiche Skala auf alle Bilder anzuwenden, die in jeder ImageJ-Sitzung analysiert werden. Andernfalls legen Sie den Maßstab für jedes Bild beim Öffnen fest (Abbildung 2D). Klicken Sie auf Ok.
      HINWEIS: Die Schritte 1.9.2-1.9.5 werden durchgeführt, um die Messskala einzustellen. Bei den Messungen für dieses Bild wird die Länge der Linien nun automatisch mit der definierten Pixel-Längen-Beziehung in Beziehung gesetzt. Bilder, die mit 300 dpi gescannt werden, haben ein ungefähres Verhältnis von 11,8 Pixeln pro mm.
   6. Verwenden Sie das Pinsel-Werkzeug, um knapp über dem ersten Punkt zu markieren, der gewertet werden soll.
      HINWEIS: Dies ist ein visueller Indikator für den ersten Wurm, der bewertet wird.
   7. Verwenden Sie das Straight-Line Tool, um eine Linie vom Mittelpunkt zum ersten Wurmdatenpunkt zu zeichnen.
   8. Klicken Sie auf die Taste M auf der Tastatur, um die Entfernung zu messen. Navigieren Sie alternativ zum Menü Analysieren und wählen Sie Messen (Analysieren | Messen). In beiden Fällen wird die Messung in einem neuen Fenster angezeigt. In diesem Fenster werden alle Messungen pro Bild erfasst.
   9. Halten Sie den Mittelpunkt konstant, verschieben Sie das Ende der Linie, die den ersten Wurmpunkt berührt, im Uhrzeigersinn zum nächsten Wurmpunkt, und klicken Sie zum Messen auf die Taste M .
   10. Messen Sie jeden Punkt im Uhrzeigersinn, bis alle Punkte erzielt wurden.
   11. Kopieren Sie und Fügen Sie Längenmessdaten in eine Tabelle ein, um sie zu speichern. Wiederholen Sie dann den Vorgang für jedes gescannte Plattenbild.
       HINWEIS: In den Schritten 1.9.6 - 1.9.11 werden die Wurmverschiebungswerte gemessen (Abbildung 2E-F).
10. Führen Sie statistische Analysen durch.
    1. Kombinieren Sie Replikationen innerhalb eines einzigen Experiments, sodass die Gesamtzahl der bewerteten Würmer zwischen 30 und 40 liegt.
    2. Führen Sie unabhängige experimentelle Replikationen an verschiedenen Tagen und mit unabhängigen Populationen von Würmern durch, um am Ende 3 unabhängige experimentelle Replikationen zu erhalten.
    3. Analysieren Sie die Daten mit geeigneten statistischen Analysen, wie z. B. dem Student's t-Test für 2 Stämme oder der 1-Wege-ANOVA für drei oder mehr Stämme.

Ergebnisse

Abbildung 1: Arbeitsablauf des Radiallokomotions-Assays. Die Tafeln A-E zeigen die verallgemeinerten Schritte des radialen Lokomotionsassays. Die Schritte sind wie folgt: (A) NGM-Platten, mit OP50 an den Rändern ausgesät, werden durch Markieren und Markieren des zentralen Punktes vorbereitet, (B) Würmer werden in der Mitte des Agars platziert, wie d...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
C. elegans	Caenorhabditis Genetikzentrum (CGC)	-	Passen Sie Ihre Stämme nach Belieben an, N2 ist ein nützlicher Kontrollstamm
Pasteurpipetten zum Einmalgebrauch, Borosilikatglas	VWR	14673-010	Glaspipette, die zur Herstellung eines Wurmpickers verwendet wird - halten Sie die Glaspipette in einer Hand und ~1" Platindraht (von einer Zange gehalten) in der anderen über einer Flamme, um sie zu verbinden.
Einweg-Petrischale, 35x10mm	VWR	10799-192	Assay-Platten für das WormLab Imaging System
Einweg-Petrischale, 60x15mm	VWR	25384-090	Lagerplatten für Würmer
Einweg-Petrischale, 100x15mm	VWR	25384-302	Standard-Assay-Platte für radiale Fortbewegung
Einweg-Petrischale, 150x15mm	VWR	25384-326	Radiale Fortbewegungs-Assay-Platte mit längerem Zeitrahmen
Präpariermikroskop	Leica	M80	Anwendungsbereich für die Pflege von Würmern und die Einrichtung von radialen Lokomotions-Assays
Marker mit feiner Spitze	VWR	52877-810	Benötigen Sie mindestens 2 Farben für radiale Lokomotions-Assays. Feine Spitzen sind für die Genauigkeit erforderlich.
Flachbett-Scanner	Amazon	Epson Perfection V850	Optional für radiale Lokomotions-Assays. Das Protokoll geht von einer Auflösung von 300dpi aus, die meisten Scanner würden gut funktionieren
NGM (Nematoden-Wachstumsmedium)	VWR	76347-412	Medium zur Kultivierung von C. elegans. Kann von Grund auf neu erstellt werden, siehe WormBook: Maintenance of C. elegans
OP50-Bakterien	Caenorhabditis Genetikzentrum (CGC)	OP50	Primäre Nahrungsquelle für C. elegans
p1000 Pipette	VWR	76207-552	Pipettor, wird im Schwimmassay verwendet
p1000 Tipps	VWR	83007-384	Spitzen für Pipette, die im Schwimmassay verwendet wird
Platindraht, Durchmesser 0,2032 mm	VWR	BT136585-5M	Feindicker Platindraht, der zur Herstellung eines Wurmpickers verwendet wird - halten Sie die Glaspipette in einer Hand und ~1" Platindraht (mit einer Zange gehalten) in der anderen über einer Flamme, um sie zu verbinden.
Herrscher	VWR	56510-001	Notwendigkeit der Bewertung von radialen Lokomotions-Assays
BildJ	NIH	-	Optionale kostenlose Software zur Verfügung gestellt von die NIH - https://imagej.nih.gov/ij/
WormLab Bildgebungssystem	MBF Biowissenschaften	WormLab	Das Bildgebungssystem umfasst WormLab-Hardware (Hellfeld Bühne, Kamera und Gehäuse) und WormLab-Software. https:// www.mbfbioscience.com/wormlabimaging- System