Alle Verfahren mit Tierproben wurden von der zuständigen Kommission für ethische Überprüfung der Tiere überprüft und genehmigt.
1. Vorbereitung
- Gewebevorbereitung und -sektion
- Ratten werden nach dem Zufallsprinzip in drei Gruppen eingeteilt: frisch/Kochsalzlösung (SAL; 0,9 % NaCl), präfixiert/SAL und präfixiert/3,4-Methylendioxymethamphetamin (MDMA; siehe Details in Tabelle 1).
- Verabreichen Sie der SAL- bzw. der MDMA-Gruppe im Abstand von 2 Stunden intraperitoneal drei Dosen von 1 ml/kg SAL bzw. 10 mg/kg MDMA. Lassen Sie die Tiere die Behandlung 6 Tage lang überleben.
- Verabreichen Sie den Ratten an Tag 7 100 mg/kg Ketamin in Kombination mit 5 mg/kg Xylazin intraperitoneal für eine Tiefenanästhesie (d.h. , Verlust des Hornhautblinzelns und der Schwanzklemmreflexe).
- Für die Frisch-/SAL-Gruppe die Ratten schnell enthaupten und das Gehirn für den frischen Gehirntest entfernen.
- Für die präfixierten/SAL- und präfixierten/MDMA-Gruppen machen Sie einen Schnitt entlang des Brustbeins etwa 10 -12 cm und legen Sie dann das Ende des Brustbeins frei.
- Halten Sie das Ende des Brustbeins mit einem Blutstiller fest und schneiden Sie das Zwerchfell mit einer scharfen Schere seitlich seitlich ab und schneiden Sie dann über die Rippen nach oben und parallel zur Lunge.
- Halten Sie mit einer Hand die ventrale Spitze des Herzens mit einer kleinen Pinzette fest. Mit der anderen Hand stechen Sie mit einer 18-G-Spritzennadel in den linken Ventrikel (beachten Sie, dass die Adapterseite der Nadel mit einem Y-förmigen Silikonschlauch mit eiskalten SAL- und Paraformaldehyd-Behältern und Schlauchpumpen verbunden ist).
- Schalten Sie die SAL-Pumpe bei mittlerer Durchflussmenge (~5 ml/min) ein und punktieren Sie mit der Pinzette den rechten Vorhof, um das Entweichen der Rückzirkulation zu ermöglichen. Halten Sie die SAL-Perfusion 30 Minuten lang aufrecht.
- Schalten Sie die Paraformaldehyd-Pumpe auf mittlerer Stufe ein und lassen Sie das eiskalte 4%ige Paraformaldehyd das Tier 30 Minuten lang durchbluten.
- Entfernen Sie das Perfusionsinstrument und enthaupten Sie das Tier. Machen Sie einen posteroanterioren Schnitt durch die Mittellinie des Schädels und klappen Sie dann den Schädel, um die Schädelhöhle freizulegen.
- Entfernen Sie das Gehirn mit einem Spatel aus der Schädelhöhle und legen Sie das Gehirn in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen mit 25 ml 4% Paraformaldehyd. Halten Sie das Gehirn in der paraformaldehydhaltigen Röhre 24 Stunden lang bei 4 ºC Kühlschrank.
- Bringen Sie das Gehirn 3 Tage lang in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen mit 25 ml 30%iger Saccharoselösung bei 4 ºC. Lagern Sie das Gehirn schließlich bis zum Gebrauch in Plastiktüten bei -80 °C.
- Montieren Sie das Gehirn auf ein Spannfutter mit Einbettungsmedien und frieren Sie das Einbettungsmedium, das das Gehirn enthält, in einem Kryostaten bei einer Temperatur von -26 ºC ein. Schneiden Sie das frisch gefrorene Gehirn in 20-μm-Abschnitte und das Gehirn mit Paraformaldehyd-Präfix in 10-μm-Abschnitte. Übertragen Sie den Schnitt auf einen Objektträger mit Raumtemperatur (RT), indem Sie den Objektträger mit dem Schnitt berühren.
- 4 Stunden lang bei RT an der Luft trocknen. Bewahren Sie die Objektträger bis zur Verwendung in einem dicht verschlossenen Beutel bei -80 °C auf.
- Austrocknung
- Nehmen Sie Objektträger aus dem -80 °C Gefrierschrank und ordnen Sie die Schnitte einem von drei Tests zu: Serotonin-5-HT2A Rezeptor-Gen (ht2a), ppiB (Peptidylprolyl-Isomerase B-Gen, Positivkontrolle) oder dapB (bakterielles Dihydrodipicolinat-Reduktase-Gen, Negativkontrolle); Markieren und beschriften Sie Abschnitte mit einem Kugelschreiber (verwenden Sie keinen Bleistift). Tauchen Sie die Dias 5 Minuten lang in 100% Alkohol bei RT. Trocknen Sie die Dias 5 Minuten lang in einem Abzug.
- Vorbehandlung
- Pipettieren Sie 20 μl des Reagenzes für die Vorbehandlung-1 (Inaktivierung der alkalischen Phosphatase) in die Schnitte auf den Objektträgern. Legen Sie die Objektträger auf eine Gestellschiene in eine Feuchtigkeitsschale (beachten Sie, dass die Schale mit einem Deckel abgedeckt ist, um eine hohe Luftfeuchtigkeit aufrechtzuerhalten und eine Verdunstung aus der Reaktionslösung zu verhindern).
- Schütteln Sie die Feuchtigkeitsschale auf einem horizontalen Shaker vorsichtig bei niedriger Geschwindigkeit für 10 Minuten. Waschen Sie die Objektträger zweimal 2 Minuten lang mit doppelt destilliertem Wasser (ddH2O). Tauchen Sie den Objektträger in ein 200-ml-Becherglas, das 150 ml des Pretreatment-2-Reagenzes enthält (Aufbrechen der durch die Paraformaldehyd-Fixierung induzierten Vernetzungen). Kochen Sie die Objektträger insgesamt 5 Minuten lang bei 100 ºC (hitzeinduzierte Wiederherstellung der RNA-Struktur).
- Waschen Sie die Dias zweimal mit ddH2O für 2 Min. Legen Sie die Objektträger für 5 Minuten in 100% Alkohol. Trocknen Sie die Dias 5 Minuten lang im Abzug. Zeichnen Sie mit einem hydrophoben Stift einen Kreis um den ausgewählten Bereich im Gewebeschnitt (, z. B. , nicht-kortikale Strukturen, einschließlich Thalamus und Hypothalamus, wie in Abbildung 1 beschrieben).
- Pipettieren Sie 10 μl des Reagenzes Pretreatment-3 (erhöht die Sondenpenetration) in jeden ausgewählten Bereich und decken Sie die Feuchtigkeitsschale mit dem Deckel ab. Stellen Sie das Blech in den Hybridisierungsofen, der mit dem horizontalen Schüttler ausgestattet ist, und stellen Sie die Ofentemperatur auf 40 ºC ein. Schütteln Sie das Tablett vorsichtig für 30 Minuten. Waschen Sie die Objektträger zweimal mit ddH2O für 2 Min.
2. Hybridisierung und Amplifikation
- Pipettieren Sie 10 μl der Sondenreagenzien htr2a, ppiB und dapB auf die ausgewählten Bereiche. Decken Sie die Feuchtigkeitsschale mit dem Deckel ab, um ein Verdampfen des Reagenzes zu verhindern. Schütteln Sie den horizontalen Shaker vorsichtig auf niedriger Geschwindigkeit. Die Objektträger bei 40 ºC im Ofen 2 Std. inkubieren.
- Waschen Sie die Folien zweimal mit einem Waschpuffer für 2 Minuten. Pipettieren Sie 10 μl des Amplification-1-Reagenzes auf jeden ausgewählten Bereich, schütteln Sie die Objektträger und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang bei 40 ºC.
- Waschen Sie die Folien zweimal mit einem Waschpuffer für 2 Minuten. Pipettieren Sie 10 μl des Amplification-2-Reagenzes auf jeden ausgewählten Bereich, schütteln Sie die Objektträger und inkubieren Sie sie 15 Minuten lang bei 40 ºC.
- Waschen Sie die Folien zweimal mit einem Waschpuffer für 2 Minuten. Pipettieren Sie 10 μl des Amplification-3-Reagenzes auf jeden ausgewählten Bereich, schütteln Sie die Objektträger und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang bei 40 ºC.
- Waschen Sie die Folien zweimal mit einem Waschpuffer für 2 Minuten. Pipettieren Sie 10 μl des Amplification-4-Reagenzes auf jeden ausgewählten Bereich, schütteln Sie die Objektträger und inkubieren Sie sie 15 Minuten lang bei 40 ºC.
- Waschen Sie die Folien zweimal mit einem Waschpuffer für 2 Minuten. Pipettieren Sie 10 μl des Amplification-5-Reagenzes auf jeden ausgewählten Bereich, schütteln Sie die Objektträger und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang bei RT.
- Waschen Sie die Folien zweimal mit einem Waschpuffer für 2 Minuten. Pipettieren Sie 10 μl des Amplification-6-Reagenzes auf jeden ausgewählten Bereich, schütteln Sie die Objektträger und inkubieren Sie sie 15 Minuten lang bei RT. Waschen Sie die Folien zweimal mit einem Waschpuffer für 2 Minuten.
3. Signalerkennung
- Pipettieren Sie 10 μl des roten Reagenzes in jeden ausgewählten Bereich (Beachten Sie, dass das Reagenz eine Mischung aus Rot-B und Rot-A im Verhältnis 1:60 ist und sofort verwendet werden sollte). Legen Sie den Objektträger in die Feuchtigkeitsschale auf den horizontalen Shaker bei RT und schütteln Sie ihn 10 Minuten lang vorsichtig bei niedriger Geschwindigkeit.
- Waschen Sie die Dias zweimal 10 Min. lang mit (ddH2O). Die Objektträger bei 60 ºC im Ofen 15 Min. trocknen. Legen Sie die Objektträger für 5 Minuten in Xylol unter den Abzug. Pipettieren Sie 20 μl Eindeckmittel auf Xylolbasis auf jede ausgewählte Stelle und decken Sie sie mit einem Deckglas ab.