Alle Verfahren mit Tierproben wurden von der zuständigen Kommission für ethische Überprüfung der Tiere überprüft und genehmigt.
1. Schneiden des Gehirns
- Richten Sie die Probe so aus, dass die dorsale Seite des Kleinhirns auf der Vorderseite liegt. Gießen Sie eiskaltes Schneiden ACSF (Künstliche Zerebrospinalflüssigkeit) ein, das 1 μM TTX (Tetrodotoxin) enthält, genug, um das Kleinhirn vollständig einzutauchen. Stecken Sie einen Gasschlauch in den ACSF und beginnen Sie mit dem Gasgemisch O2/CO2 zu sprudeln.
- Entfernen Sie die Arachnoidea mit einer feinen Pinzette unter dem Fernglas. Schneiden Sie den Kleinhirnstiel mit einer Klinge ab und entfernen Sie den Hirnstamm und den Agarblock. Drehen Sie das Tablett um 180°, so dass die dorsale Oberfläche des Kleinhirns einer Rasierklinge zugewandt ist.
- Setzen Sie die Klinge ein und stellen Sie die erste Schnittposition ein. Stellen Sie die Vibratome-Slicing-Parameter auf Folgendes ein: Amplitude auf 5,5, Frequenz auf 85 Hz, Geschwindigkeit auf 3–4 und Schichtdicke auf 300 μm.
- Übertragen Sie die Kleinhirnscheibe auf einem Nylonnetz in einen Acryl-Inkubator und tauchen Sie die Scheibe vollständig in das sauerstoffhaltige ACSF. Der Inkubator sollte in ein Wasserbad gestellt werden, das eine Temperatur von 26 °C hält.
- Lagern Sie die Scheiben mindestens 1 Stunde lang, damit sie sich von den Schäden während des Schneidens erholen können.
2. Ganzzell-Patch-Clamp-Aufnahme
HINWEIS: Für eine Patch-Clamp-Aufzeichnung ist folgende Ausrüstung erforderlich: ein aufrechtes Mikroskop mit Infrarot-Differenzinterferenzkontrastoptik (IR-DIC), ein Patch-Clamp-Verstärker, ein Datendigitalisierer, ein digitaler Stimulator, ein Isolator, ein Computer, eine Software zur Datenerfassung und -analyse, ein motorisierter Manipulator, eine Mikroskopplattform, ein Schwingungsisolationstisch, ein Faradayscher Käfig, ein Lösungsheizsystem, peristaltische Pumpen und ein Elektrodenabzieher.
- Fügen Sie Picrotoxin (0,1 mM) zu ACSF hinzu und lösen Sie es 3 Minuten lang mit Ultraschall auf.
- Eine Aufzeichnungskammer wird mit Pikroxin-haltigem, O2-CO2-gesättigtem ACSF mit einer Geschwindigkeit von 2 mL/min perfundiert. Halten Sie die Temperatur der Aufnahmekammer bei etwa 30 °C.
- Stellen Sie eine Aufzeichnungselektrode her, indem Sie eine Borosilikatglaskapillare mit Filament (Außendurchmesser = 1,5 mm) mit einem Abzieher in 4 Stufen ziehen. Der Spitzendurchmesser sollte etwa 1 μm betragen.
- Stellen Sie eine Stimulationselektrode her, indem Sie mit dem Abzieher in 2 Schritten an derselben Kapillare ziehen, und brechen Sie dann, um eine feine Spitze zu erzeugen, indem Sie die Spitze unter einem binokularen Mikroskop gegen einen Eisenblock schlagen. Der Enddurchmesser sollte 3–5 μm betragen.
- Übertragen Sie die Kleinhirnscheibe in die Aufnahmekammer und fixieren Sie sie mit einem Pt-Gewicht mit Nylonfäden. Füllen Sie eine Stimulationselektrode mit ACSF.
- Zur Stimulation der PFs platzieren Sie die Stimulationselektrode auf der Oberfläche der Molekülschicht, etwa 50 μm von der Purkinje-Zellschicht entfernt.
- Zur Stimulation der Mukoviszidose platzieren Sie die Stimulationselektrode am unteren Rand der Purkinje-Zellschicht (Schritte 3.3, 3.4).
- Filter K+-basierte oder Cs+-basierte interne Lösung mit einem 0,45-μm-Filter. Verwenden Sie einen Mikrolader, um eine Aufzeichnungselektrode mit 8 μl interner Lösung zu füllen.
- Üben Sie einen schwachen Überdruck auf die Aufzeichnungselektrode aus, bevor Sie sie in den ACSF eintauchen. Sein Widerstand sollte 2–4 MΩ betragen und das Potential der flüssigen Übergänge sollte korrigiert werden.
- Nähern Sie sich mit der Aufzeichnungselektrode dem gesunden, hellen Zellkörper des PCs. Schieben Sie die Oberfläche der Purkinje-Zelle leicht an, hören Sie auf, Überdruck auszuüben, und üben Sie anschließend Unterdruck aus, bis sich eine Giga-Ohm-Dichtung bildet. Stellen Sie dann die Ganzzellenkonfiguration mit Unterdruck her.
- Halten Sie das Membranpotential bei -70 mV und legen Sie einen Impuls von -2 mV (Dauer, 100 ms) bei 0,1 Hz an, um den Eingangswiderstand, den Serienwiderstand und die Eingangskapazität kontinuierlich zu überwachen. Verwenden Sie nicht die Serienwiderstandskompensation. Daten werden verworfen, wenn der Serienwiderstand um mehr als 15 % variiert.
3. Induktion von LTD (Langzeitdepression)
- Stimulieren Sie die molekulare Schicht mit einem Impuls (Dauer, 0,1 ms). Identifizieren Sie die PF(Parallel fibers)-exzitatorischen postsynaptischen Ströme (EPSC) durch Anlegen eines Doppelpulsstimulus (Interspike Interval (ISI) von 50 ms). Der PF-EPSC sollte eine gepaarte Pulserleichterung und eine allmähliche Zunahme der Amplitude im Verhältnis zur Erhöhung der Stimulationsintensität zeigen.
- Zeichnen Sie die Testantwort des PF-EPSC auf, indem Sie einen einzelnen Impuls mit 0,1 Hz anlegen. Stellen Sie die Intensität des Stimulus so ein, dass die evozierte EPSC-Amplitude etwa 200 pA beträgt. Vermeiden Sie eine Kontamination des Stroms durch den spannungsabhängigen Ionenkanal.
- Stimulieren Sie die Mukoviszidose am unteren Rand der Purkinje-Zellschicht und identifizieren Sie die EPSC, die durch die Aktivierung der Mukoviszidose ausgelöst wird (durch Anwendung eines Doppelpulsreizes). Das CF-EPSC sollte eine gepaarte Pulsdepression und eine Alles-oder-Nichts-Manier entsprechend der Erhöhung der Stimulationsintensität zeigen. Für die LTD-Induktion sollte ein einziger Stimulus verwendet werden.
- LTD-induzierendes Protokoll 1
- Mit einer Elektrode, die eine auf K+ basierende interne Lösung enthält, wird unter Stromklemmenbedingungen ein einzelner PF-Stimulus und ein einzelner CF-Stimulus gleichzeitig bei 1 Hz für 5 min (300 Impulse) angelegt (Abbildung 1A).
- LTD-induzierendes Protokoll 2
- Unter Verwendung einer elektrodenhaltigen K+-basierten internen Lösung unter Stromklemmenbedingungen werden doppelte PF-Stimuli (ISI von 50 ms) und ein einfacher CF-Stimulus angewendet, da der zweite PF-Stimulus 5 min lang mit CF-Stimuli bei 1 Hz zusammenfällt (Abbildung 1B).
- LTD-induzierendes Protokoll 3
- Unter Verwendung einer Elektrode, die eine Cs+-basierte interne Lösung unter Voltage-Clamp-Bedingungen enthält, wird ein doppelter PF-Stimulus (ISI von 50 ms) und ein einzelner depolarisierender Spannungsschritt (-70 bis 0 mV, 50 ms) für 3 min an das Soma bei 1 Hz angelegt, so dass der zweite PF-Stimulus dem Beginn des depolarisierenden Spannungsschritts entspricht (Abbildung 1C).
- LTD-induzierendes Protokoll-4
- Mit einer Elektrode, die eine Cs+-basierte interne Lösung unter Voltage-Clamp-Bedingungen enthält, legen Sie die PF-Stimuli (5x bei 100 Hz) und einen einzelnen depolarisierenden Spannungsschritt (-70 bis 0 mV, 50 ms) gleichzeitig auf das Soma bei 0,5 Hz für 3 min an (Abbildung 1D).
