Ein in vitro Modell zur Untersuchung der Überquerung der Blut-Hirn-Schranke durch Krankheitserreger und der Infektion von Gehirnzellen

Zusammenfassung

Quelle: da Costa, A., et al. Ein menschliches Blut-Hirn-Schnittstellenmodell zur Untersuchung von Barriereüberquerungen durch Krankheitserreger oder Medikamente und deren Wechselwirkungen mit dem Gehirn. J. Vis. Exp. (2019).

Dieses Video zeigt ein In-vitro-Modell zur Untersuchung von Krankheitserregern, die die Blut-Hirn-Schranke (BHS) überwinden. Mikrovaskuläre Endothelzellen, die Tight Junctions exprimieren, bilden eine Endothelschicht in der oberen Kammer, während Neuronen, Astrozyten und Mikroglia das Hirnparenchym in der unteren Kammer darstellen, das durch eine poröse Membran getrennt ist. Die Virusinfektion im BHS-Modell ahmt den Erreger nach, der vom Blut ins Gehirn gelangt. Bei der Einführung eines neurotropen Virus überquert es die BHS durch Transzytose, infiziert Nervenzellen, repliziert sich und setzt virale Nachkommen frei, was eine erfolgreiche Neuroinvasion zeigt.

Protokoll

1. Aufbau und Qualitätskontrolle des BHS-Minihirns (Blut-Hirn-Schranke - Minihirn) (Abbildung 1)

1. Einrichten eines BBB-Minibrain Polyester-Membrankultureinsatzgeräts (Abbildung 1B)
   1. Züchten Sie die Endothelzelllinie des menschlichen Gehirns (hCMEC/D3-Zellen) auf 12-Well-Polyestermembrankulturen, setzen Sie Filter 6 Tage lang auf Endothelzellmedium ein, bevor Sie sie für das Experiment verwenden.
   2. Eine 12-Well-Platte mit Poly-D-Lysin (1 ml/Well, 10 μg/mL, 4 h bei RT) und dann mit Laminin (1 mL/Well, 1 μg/mL, über Nacht bei RT) beschichten.
   3. Entfernen Sie Laminin und fügen Sie 1 ml Endothelzellmedium hinzu, das mit 5 % fötalem Rinderserum (FBS) (5 % Endothelzellmedium) ergänzt wird.
   4. 1 h bei 37 °C, 5 % CO₂ und 95 % Luftfeuchtigkeit inkubieren.
   5. Trypsinisieren Sie schonend die postmitotischen menschlichen Neuronen (hNeuronen) und humanen Astrozyten (hAstrozyten) (NT2-N/A) sowie die humane Mikrogliazelllinie (CHME/Cl5) und dissoziieren Sie die Zellpellets mit vollständigem Endothelzellmedium.
   6. Zählen Sie die Zellen, mischen Sie 3,6 x 10⁵ NT2-N/A und 0,4 x 10⁵ CHME/Cl5-Zellen/Well und säen Sie die 12-Well-Platte.
   7. Bei T=24 h (24 h nach der Aussaat): Wechseln Sie das verwendete Medium durch frisches vollständiges Endothelzellmedium (Minibrain-Zellen und Endothelzellen) und übertragen Sie den hCMEC/D3 Polyester-Membran-Kultureinsatzfilter auf die Oberseite der Minibrain-Zellen. Inkubieren Sie das BBB-Minibrain bei 37 °C, 5% CO₂ und 95% Luftfeuchtigkeit.
      HINWEIS: Das BHS-Minihirn besteht dann aus einer Schicht menschlicher Endothelzellen hCMEC/D3 auf einem Filter, der das luminale Kompartiment (oder "Blut"-Kompartiment) isoliert, und aus einer Mischkultur aus menschlichen Zellen hNT2-N/A und hCHME/Cl5 (Minihirn) am Boden der Vertiefung, die das abluminale Kompartiment (oder "Gehirn"-Kompartiment) definiert (Abbildung 1B).
2. Validierung der endothelialen Permeabilität des BHS-Minihirns (Qualitätskontrolle) (Abbildung 1C)
   1. Bereiten Sie den Transportpuffer (TB) vor, bei dem es sich um einen HBSS-Puffer (Hanks' Balanced Salt Solution) mit Ca²⁺ und Mg²⁺ handelt, ergänzt mit 10 mM 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethensulfonsäure (HEPES) und 1 mM Natriumpyruvat.
   2. Bereiten Sie 12-Well-Platten mit 1,5 mL Transportpuffer pro Well vor.
   3. Bei T= 0 wird frischer Transportpuffer hergestellt, der mit 50 μM Lucifer Yellow (LY-TB) ergänzt wird.
   4. Drehen Sie jeden Filter auf den Kopf, um das Medium vorsichtig zu entfernen, ohne die Endothelzellbarriere zu beeinträchtigen.
   5. Setzen Sie den Filter auf die gefüllte 12-Well-Platte und fügen Sie 0,5 mL LY-TB hinzu.
   6. Inkubieren Sie die Platten in einem Inkubator bei 37 °C, 5 % CO₂ und 95 % Luftfeuchtigkeit.
   7. Bei T=10 min werden die Filter auf neue, mit TB gefüllte 12-Well-Platten übertragen und das abluminale Fach der ersten Platte für die OD-Messung beibehalten.
   8. Bei T= 25 min wiederholen Sie Schritt 1.2.7.
   9. Bei T= 45 min stoppen Sie den Transport, indem Sie die Filter von den Platten entfernen. Bewahren Sie abluminale und luminale Fächer für OD-Messungen auf.
   10. Übertragen Sie die Proben in eine dunkle 96-Well-Platte: 10 μl mit 190 μl TB für die LY-TB und die luminalen Kompartimente, 200 μl Probe für die abluminalen Kompartimente.
   11. Messen Sie die Fluoreszenz der LY-TB, die in den verschiedenen Proben bei λ428 nm λ535 nm vorhanden ist (Anregungs- bzw. Emissionslängenwellen).
   12. Berechnen Sie die endotheliale Permeabilität (Pe) gegenüber LY-TB (Pe_LY) mit der Formel:
       1/PSe= (1/PSt) – (1/PSf) und PE_LY= PSe/S.
       HINWEIS: PSf ist die Permeabilität des Filters ohne Zellen, PSt ist die Permeabilität des Filters mit Zellen, PSe ist die Permeabilität der endothelialen Monoschicht Zeit der Oberfläche der Monoschicht, S ist die Oberfläche der Monoschicht (für einen 12-Well-Filter = 1,12 cm²), Pe_LY wird in cm/min ausgedrückt. Für hCMEC/D3 sollte der Pe_LY zwischen 0,7 und 1,2 x 10^-3 cm/min liegen, hauptsächlich abhängig von dem in den Experimenten verwendeten FBS. Wichtig: Ein Pe_LY höher als 1,2 bedeutet, dass die BHS nicht dicht genug ist und eine gewisse Leckage zu beobachten ist. Beseitigen Sie diese Barrieren.

2. Verwendung von BBB-Minibrain zur Hervorhebung des Vorhandenseins von neuroinvasiven Viruspartikeln in einer Gelbfiebervirus-Impfstoffprobe, dem französischen neurotropen Virus, YFV-FNV 34 (Abbildung 2)

1. BHS-Kreuzung und Vermehrung von Gelbfieberviren im Minibrain
   1. Verwenden Sie das wie in Schritt 1.1.7 beschriebene BBB-Minibrain 24 h vor der Zugabe des Virus; Ersetzen Sie das Medium durch 2% FBS-Endothelzellmedium.
      HINWEIS: Es ist äußerst wichtig, dass Sie das Medium nicht kurz vor dem Hinzufügen des Virus wechseln. Ein Wechsel des Mediums kann die menschlichen Endothelzellen aktivieren und die Barriere vorübergehend öffnen, wodurch das Virus passieren kann. Hier wird das Medium 24 h vor Beginn des Experiments gewechselt.
   2. Bei T= 0 geben Sie 3500 Plaque Forming Units (PFU) YFV-FNV, verdünnt in 50 μl 2 % FBS-Endothelzellmedium, sehr vorsichtig auf die Oberseite des luminalen Kompartiments. Das Kontroll-BBB-Minibrain wird mit 50 μL 2% FBS-Endothelzellmedium ohne Viren beimpft. Bestimme Pe_LY auf dem Gefährtenbrunnen.
   3. Inkubieren Sie das BBB-Minibrain in einem Inkubator bei 37 °C, 5% CO₂ und 95% Luftfeuchtigkeit.
   4. Entfernen Sie nach 24 Stunden die Filtervorrichtung für die Polyestermembran-Kultureinsätze und bestimmen Sie Pe_LY, nehmen Sie eine Probe von 1 ml aus dem abluminalen Kompartiment und titrieren Sie das Virus. Ersetzen Sie das Medium durch frisches 2% FBS-Endothelzellmedium.
   5. Inkubieren Sie das BHS-Minihirn bei 37 °C, 5% CO₂ und 95% Luftfeuchtigkeit.
   6. Nach 72 Stunden nehmen Sie eine Probe des Mediums aus dem abluminalen Kompartiment und titrieren das Virus und/oder extrahieren Sie die RNA aus den Minibrain-Zellen für die Genexpressionsanalyse.

Ergebnisse

Abbildung 1: Das BBB-Minibrain-Modell. A. Zeitplan der hCMEC/D3-Kulturen und Foto des BBB-Minibrain-Geräts: Ein Polyester-Membran-Kultureinsatz-Filter mit hCMEC/D3-Endothelbarriere wird mit einer Pinzette gehalten, bevor er in eine Vertiefung einer 12-Well-Zellkulturplatte eingeführt wird. B. Karikatur, die das Gerät mit dem luminalen (Blut) Kompartiment, das die Endothelzellbarriere...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
12-Well-Platten	Corning	3336
85mm Petrischale	Sarstedt	83-3902-500
CHME/Cl5	Unité de Neuroimmunologie Virale	Auf Anfrage an Dr. Lafon
CMC	Calbiochem	217274
Dunkle 96-Well-Platten	Corning	3915
DMEM F12	Thermofisher Wissenschaftlich	31330-038
DMSO	Merck-Sigma Aldrich	D2650
Endogro IV	Millipore	SCME004
Ethanol	Carlo Erba	529121
FBS	Hyclone	SV30015-04	Endothelzellmedium
HBSS mit Ca2+-Mg2+	Thermofisher Wissenschaftlich	14025-100
hCMEC/D3	Zedernlan	CLU512
Hepes 1M	Thermofisher Wissenschaftlich	15630-070
Laminine	Merck-Sigma Aldrich	L6274
L-Glutamin	Thermofisher Wissenschaftlich	25030-024
Luzifer-Gelb	Merck-Sigma Aldrich	L0259
MEM 10X	Thermofisher Wissenschaftlich	21430
MEM 1X	Thermofisher Wissenschaftlich	42360
ntera/cl2D.1	ATCC	CRL-1973
Paraformaldehyd	Elektronenmikroskopie	15714
PBS ohne Ca2+-Mg2+	Thermofisher Wissenschaftlich	14190
PBS-CA2+-MG2+	Thermofisher Wissenschaftlich	14040-091
Stift/Strepto	Eurobio	CXXPES00-07
Poly-d-Lysin	Merck-Sigma Aldrich	P1149
Gold verlängern	Thermofisher Wissenschaftlich	P36930
RNA-Aufreinigungskit	QIAGEN	74104
Natriumbikarbonat 5,6%	Eurobio	CXXBIC00-07
Natriumpyruvat	Thermofisher Wissenschaftlich	11360
T75 Zelle + Kolben	Sarstedt	83-1813-302	Gewebekultur-Polystyrolflasche mit spezifischer Oberflächenbehandlung (Cell+) für empfindliche adhärente Zellen
Transwell	Corning	3460	poröse Membrankultureinsätze aus Polyester
Trypsin-EDTA	Merck-Sigma Aldrich	T3924
Reinstes Wasser	Thermofisher Wissenschaftlich	10977-035
Versene	Thermofisher Wissenschaftlich	15040-033	EDTA
YFV-FNV	IP Dakar	Durchstechflasche mit Impfstoff