1. Vorbereiten von Fliegen für MultiColor FlpOut (MCFO) Experimente
HINWEIS: Die MCFO-Technik bezieht sich auf eine modifizierte Version der sogenannten Flp-vermittelten Stoppkassetten-Exzision (FlpOut). Transgene MCFO-Fliegen tragen eine Hitzeschock-Promotor (hsp)-Flp-Rekombinase und verschiedene Reporter, die unter der Kontrolle der Upstream-Aktivierungssequenz (UAS) stehen. Jeder Reporter besteht aus einem gemeinsamen Rückgrat eines myristoylierten (myr) Super Folder Green Fluorescent Protein (sfGFP), in das 10 Kopien eines Epitop-Tags (e.g., HA, FLAG oder V5) eingefügt wurden. Die dabei entstehenden nicht-fluoreszierenden Proteine werden als "Spaghettimonster-GFPs" (smGFPs) bezeichnet und können mit spezifischen Antikörpern gegen die verschiedenen Epitop-Tags nachgewiesen werden.
- Kreuzflüge mit der MCFO-Kassette und dem hsp-Flp (hsp-Flp; 10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-HA,10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-FLAG, 10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-V5) zu den entsprechenden glialen GAL4-Treiberlinien (siehe Materialtabelle).
- Da das hsp bereits bei 25 °C aktiv ist und nur wenige Zellen rekombiniert werden können, was zu einer unspezifischen Markierung führt, sollten Kreuzungen bei 18 °C eingerichtet werden, um eine Leckage des Systems zu vermeiden. Warten Sie etwa 20 Tage bei 18 °C, um die F1-Generation zu erhalten. Halten Sie die Fliegen nach dem Hitzeschock (siehe Schritt 2) bei 25 °C (Abbildung 1).
2. Hitzeschock
HINWEIS: Je nach Einstichstelle kann die Effizienz des hsp-Flp unterschiedlich sein; Daher muss die optimale Hitzeschockzeit optimiert werden. Für dieses Protokoll wurde ein MCFO-Fliegenstock verwendet, bei dem das hsp-Flp auf dem X-Chromosom eingefügt wurde (siehe Table of Materials).
- Die Nachkommen der Kreuzung in Schritt 1.1 (Fliege der F1-Generation, 3-4 Tage alt) werden in neue Fläschchen mit Futter überführt und bei 37 °C in einem Wasserbad einem Hitzeschock unterzogen.
HINWEIS: Junge Fliegen (1-2 Tage alt) reagieren sehr empfindlich auf Hitzeschocks. Warten Sie noch 1 oder 2 Tage, bevor Sie den Hitzeschock durchführen, um die durch die Behandlung verursachte Sterblichkeitsrate zu senken. Verwenden Sie einige Fliegen der F1-Generation als Kontrolle, ohne Hitzeschock.
- Halten Sie während des Hitzeschocks Fliegen in normalen Fläschchen mit Futter aufrecht, um die stressbedingte Sterblichkeit zu senken. Weibliche und männliche Tiere in getrennte Durchstechflaschen geben.
- Achten Sie darauf, das gesamte Fläschchen in das Wasser zu tauchen, um einen gleichmäßigen Hitzeschock zu gewährleisten. Verwenden Sie einen 5-8-minütigen Schock als geeigneten Ausgangspunkt für die spärliche Markierung von Gliazellen mit vielen GAL4-Treiberlinien; Die Schockdauer muss für jeden Treiber und jedes Experiment optimiert werden (kürzere oder längere Hitzeschockzeiten können erforderlich sein).
- Legen Sie die Fläschchen nach dem Hitzeschock einige Minuten waagerecht auf die Bank, damit sich die Fliegen vom Hitzeschock erholen können.
HINWEIS: Es ist nicht notwendig, die Fläschchen zu wechseln.
- Halten Sie die Fliegen bei 25 °C und präparieren Sie sie 2 oder mehr Tage nach dem Hitzeschock (siehe Schritt 3 und 4), um eine optimale Reporterexpression zu erzielen.
3. Vorbereitung der Präparierung und Lösungen
- Bereiten Sie am Tag der Dissektion eine frische Fixierlösung in 200 μl PCR-Röhrchen vor, indem Sie 180 μl S2-Zellkulturmedium mit 20 μl 20 % Paraformaldehyd (PFA) mischen, um eine 2 %ige PFA-Lösung zu erhalten. Halten Sie die Fixierlösung vor und während der Dissektion auf Eis.
Achtung: PFA ist giftig und muss mit Vorsicht behandelt werden.
HINWEIS: Mischen Sie 160 μl S2-Zellkulturmedium mit 40 μl 20 % Paraformaldehyd (PFA) in einem 200 μl Polymerase-Kettenreaktionsröhrchen (PCR), um eine 4%ige PFA-Lösung anstelle einer 2%igen Lösung herzustellen.
- Verwenden Sie ein PCR-Röhrchen pro Genotyp mit maximal 8-10 Gehirnen pro Röhrchen, um optimale Färbeergebnisse zu erzielen.
- Bereiten Sie die Gehirnwaschlösung für Erwachsene vor: 0,5 % Rinderserumalbumin, 0,5 % Triton X-100 in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
HINWEIS: Je nach Färbung kann eine Lösung mit 1% Triton X-100 erforderlich sein. Eine höhere Konzentration von Triton X-100 erhöht das Eindringen des Antikörpers in das Gewebe und es ist notwendig, Regionen zu färben, die tief im Gewebe liegen (z.B. synaptische Regionen im erwachsenen Drosophila Gehirn).
- Bereiten Sie die Blockierungslösung vor: 3 % normales Ziegenserum, 3 % normales Eselserum und 0,5 % Triton X-100 in PBS.
- Die Gehirnwaschlösung für Erwachsene und die Blockierungslösung können einige Wochen lang bei 4 °C gelagert werden.
- Legen Sie die Glasplatte der tiefen Vertiefungswellen auf Eis und füllen Sie jede Vertiefung mit den folgenden Lösungen: eine mit 70 % Ethanol, eine mit PBS und eine mit S2-Zellkulturmedium.
4. Dissektion des Gehirns bei Erwachsenen
- Stellen Sie eine 3 cm große Präparierschale auf den Tisch eines Stereomikroskops und füllen Sie sie mit kaltem S2-Zellkulturmedium. Führen Sie alle Dissektionen in diesem Medium durch, um sicherzustellen, dass das Gewebe während der Dissektion gesund bleibt.
HINWEIS: Verwenden Sie eine Präparierschale, die mit mehreren Millimetern schwarzem Silikon ausgekleidet ist, das einen guten Hintergrundkontrast (in den Bildern) bietet, und bewahren Sie die Pinzette während der Dissektion auf.
- Betäuben Sie die Fliegen des gewünschten Genotyps mit CO2.
- Fassen Sie die Fliege mit einer Pinzette an den Flügeln und waschen Sie sie 30 s lang in kaltem 70 % Ethanol, dann weitere 30 s mit kaltem PBS.
- Übertragen Sie die Fliege in die Vertiefung der Tiefe, die mit S2-Zellkulturmedium gefüllt ist.
- Wiederholen Sie das gleiche Verfahren für alle Fliegen desselben Genotyps und bewahren Sie sie bis zur Dissektion in kaltem S2-Zellkulturmedium auf, wodurch das Gewebe erhalten bleibt.
HINWEIS: Betäuben Sie nur die Anzahl der Fliegen, die in einem Zeitraum von ca. 30 Minuten präpariert werden können. Lange Inkubationszeiten in S2-Zellkulturmedium können das Gewebe schädigen.
- Fassen Sie die Fliege mit einer Pinzette und tauchen Sie sie unter einem Stereomikroskop in S2-Zellkulturmedium.
- Löse den Kopf vom Rest des Körpers. Entsorgen Sie den Körper und halten Sie den Kopf in S2-Zellkulturmedium getaucht. Es ist äußerst wichtig, den Kopf während der gesamten Dauer der Dissektion mit einer Pinzette zu halten. Wenn der Kopf zu schweben beginnt, wird es schwierig sein, ihn zu bergen, ohne das Gewebe zu beschädigen.
- Beginnen Sie die Dissektion, indem Sie ein Auge herausziehen, während Sie den Kopf immer mit mindestens einer Pinzette halten. Achten Sie darauf, dass sich die Spitze der Pinzette direkt unter der Netzhaut befindet, um das darunter liegende Gewebe nicht zu beschädigen. Ziehe das andere Auge heraus und beginne, die Nagelhaut zu entfernen, bis das Gehirn zum Vorschein kommt.
- Entfernen Sie das gesamte Luftröhrengewebe und die Kutikula um das Gehirn herum, bis das Gewebe sauber erscheint. Stellen Sie sicher, dass Sie das gesamte Luftröhrengewebe um das Gehirn herum entfernen, um optimale Färbeergebnisse zu erzielen. Die Gewebe sind nun bereit, fixiert und gefärbt zu werden.
- Bewahren Sie alle präparierten Gehirne in kaltem S2-Zellkulturmedium auf, bevor Sie sie in die PFA-Lösung überführen, um den Fixierungsschritt zu planen.
5. Hirnfärbung bei Erwachsenen
- Übertragen Sie das isolierte Gehirn mit einer P10-Pipette in die PFA-Lösung bei Raumtemperatur (RT). Um Gewebeschäden zu vermeiden, verwenden Sie nach der Dissektion niemals eine Pinzette für den Transfer des Gehirns. Führen Sie alle Schritte in 200 μl PCR-Röhrchen auf einem Nährstoffator durch.
- Lassen Sie bei allen Schritten, bevor Sie die alte Lösung mit einer P200-Pipette verwerfen, das Gehirn auf dem Boden des Röhrchens absetzen. Versuchen Sie, den Überstand zu entfernen, ohne das Gewebe abzusaugen. Schützen Sie das Gewebe vor Lichteinwirkung.
- Fixieren Sie das Gehirn 1 h lang in 200 μl 2 % PFA in S2-Zellkulturmedium oder 30 Minuten lang in 4 % PFA. Halten Sie die Fixierzeiten zwischen den Proben identisch, um die Reproduzierbarkeit zu erhöhen.
- Nach 3 (oder mehr) Waschgängen von je 15 Minuten in 200 μl Gehirnwaschlösung für Erwachsene blockieren Sie das Gewebe 30 Minuten lang mit 200 μl Blockierungslösung. Längere Inkubationszeiten in Blocklösung sind möglich.
- Inkubieren Sie das Gehirn über Nacht bei 4 °C mit Primärantikörpern, die in Gehirnwaschlösung für Erwachsene mit einem Gesamtvolumen von 200 μl verdünnt sind.
HINWEIS: Die Inkubationszeiten können je nach Art des verwendeten Antikörpers variieren. Längere Inkubationen können erforderlich sein.
- Zur Markierung der drei MCFO-Marker inkubieren Sie das Gehirn mit anti-HA (1:500), anti-FLAG (DYKDDDDK Epitop) (1:100) und anti-V5 Antikörpern.
- Anstelle der normalen primären + sekundären Kombination könnten primäre direkt konjugierte Antikörper verwendet werden (z.B., anti-V5:DyLight 549 (1:200)). Behandeln Sie in diesem Fall die direkt konjugierten Antikörper als Sekundärantikörper.
HINWEIS: Behalten Sie für jeden Genotyp einige Gehirne als Kontrollen, um die Spezifität der Färbung zu überprüfen. Überspringen Sie die Inkubation des Primärantikörpers und fahren Sie direkt mit dem nächsten Schritt fort.
- Waschen Sie das Gewebe 3 Mal für 1 Stunde in 200 μl Gehirnwaschlösung für Erwachsene (Schritt 3.3) und inkubieren Sie es mit sekundären Fluorophor-Konjugaten/primären direkt konjugierten Antikörpern, die über Nacht bei 4 °C oder 4 Stunden lang bei RT in einer Gehirnwaschlösung für Erwachsene verdünnt wurden, in einem Gesamtvolumen von 200 μl
HINWEIS: Beispiele für geeignete Antikörper: AlexaFluor 488 (1:250), anti-V5:DyLight 549 (1:200) und DyLight 647 (1:100)-konjugierte Antikörper.
- Waschen Sie das Gehirn 3 Mal für 1 h in 200 μl Gehirnwaschlösung für Erwachsene, gefolgt von einer abschließenden Wäsche in 200 μl PBS über Nacht bei 4 °C oder für 1-2 h bei RT; Der letzte Waschschritt in PBS entfernt alle Spuren von Triton X-100 und ist für ein optimales Färbeergebnis erforderlich. Montieren Sie die Gehirne in Eindeckmittel mit einem Anti-Fade-Mittel auf Glasdeckgläser.
6. Montage von Gehirnen für die Bildgebung
- Schneiden Sie einen Abstandshalter mit einer Schere auf die richtige Größe zu. Für eine hochauflösende Mikroskopie klemmen Sie die Probe und den Abstandshalter zwischen zwei Glasabdeckgläsern.
HINWEIS: Abstandshalter für die Bildgebung sind dünne (0,12 mm dicke) selbstklebende Abstandshalter, die sich ablösen und an Glasdeckgläsern oder Objektträgern haften und so die Montage von Proben ohne Kompression ermöglichen.
- Entfernen Sie mit einer Pinzette die Klebefolie von einer Oberfläche und tragen Sie den Abstandshalter mit der Klebeseite nach unten auf die Oberfläche eines Glasdeckglases (22 mm x 60 mm) auf. Tragen Sie 10 μl Eindeckmedium auf ein neues Glasdeckglas auf.
- Übertragen Sie mit einer P10-Pipette das Gehirn aus dem 200-μl-Röhrchen auf das Deckglas, neben dem Tropfen Einbettmedium. Übertragen Sie zusammen mit dem Gewebe etwas PBS, um das Gehirn in Lösung zu halten.
- Bewegen Sie mit einer P10-Pipette das Gehirn vom PBS zum Tropfen des Einbettmediums, um die Menge an PBS zu begrenzen. Übertragen Sie die Proben in Einbettmedium auf das Deckglas mit dem Abstandshalter. Verwenden Sie genügend Einbettmedien, um die Probe abzudecken.
- Entfernen Sie die andere Klebefolie von der Oberseite des Abstandshalters und kleben Sie ein Glasdeckglas auf die Proben. Üben Sie mit der Spitze einer Pinzette einen sanften Druck auf die Klebefläche aus, um sie zu versiegeln. Bilden Sie die montierten Gewebe sofort ab oder lagern Sie die Objektträger bei -20 °C für eine spätere Analyse.
