Eine stereotaktisch gesteuerte Ablationstechnik zur Entfernung der auditorischen Hirnrinde bei Ratten

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom örtlichen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

1. Vorbereitung der Ratte

HINWEIS: Wir haben die Experimente an männlichen Ratten durchgeführt, um hormonelle Veränderungen zu vermeiden.

1. Betäuben Sie das Tier mit einer Mischung aus Ketaminhydrochlorid (30 mg/kg) und Xylazinhydrochlorid (5 mg/kg), die intramuskulär injiziert wird. Mit dieser Dosis sollte die Ratte etwa 1 h lang tief betäubt werden.
2. Kneifen Sie der Ratte in die Zehe; Das Fehlen eines Entzugsreflexes deutet darauf hin, dass das Tier völlig bewusstlos ist. Wenn die Ratte auf die Prise anspricht, geben Sie eine zusätzliche Anästhesie mit einem Drittel der Anfangsdosis.
3. Rasieren Sie die Kopfhaut und desinfizieren Sie den Operationsbereich mit Povidon-Jod.
4. Legen Sie das Tier auf ein Heizkissen, um eine Temperatur von 38 °C zu halten, und stabilisieren Sie den Kopf des Tieres in einem stereotaktischen Rahmen mit zwei Ohrstangen und einer Beißstange. Seien Sie vorsichtig, um das Trommelfell nicht mit den Ohrstangen zu durchstechen.
5. Schützen Sie die Augen, indem Sie einen Tropfen Augengel oder Serum-Kochsalzlösung auf jedes Auge auftragen.

2. Lage des AC im Schläfenbein der Ratte

1. Machen Sie mit einem Skalpell einen Schnitt entlang der Mittellinie, um den Schädel freizulegen und das Periost, das die Oberfläche des Schädels bedeckt, zurückzuziehen.
2. Verwenden Sie ein steriles Wattestäbchen, um vorsichtig jegliches Blut zu entfernen, das die Oberfläche des Schädels bedeckt, um Bregma, Lambda und interaurale 0 gemäß dem Paxinos- und Watson-Atlas des Rattengehirns sichtbar zu machen.
3. Machen Sie mit einem Skalpell einen Schnitt in den Schläfenmuskel in der Nähe seines dorsalen Ansatzes am Schädel. Ziehen Sie den Muskel mit einer Nadel und Nahtmaterial heraus und befestigen Sie das Nahtmaterial am stereotaktischen Rahmen. Dadurch wird das Schläfenbein freigelegt. Wenn Blutungen auftreten, spülen Sie es mit kalter, steriler Kochsalzlösung aus.
4. Legen Sie eine sterile gerade Nadel in den stereotaktischen Mikromanipulator und stellen Sie sicher, dass sie vollständig gesichert ist.
5. Senken Sie die Nadel langsam ab, bis sie sich direkt über der Schädeloberfläche befindet, so dass die Spitze der Nadel auf interaural 0 eingestellt ist. Setzen Sie diesen Punkt auf Null und bestimmen Sie die Koordinaten von diesem Punkt aus.
6. Variieren Sie je nach interessiertem Hirnbereich die stereotaktischen Koordinaten. Bestimmen Sie diese Koordinaten, indem Sie den Paxinos- und Watson-Atlas des Rattengehirns verwenden. Nachdem Sie die Koordinaten bestimmt haben, bewegen Sie die Nadel so, dass sie mit diesen Koordinaten übereinstimmt.
7. Richten Sie das AC anhand der Koordinaten der folgenden vier Punkte aus: A: anteroposterior (A/P) = -5,8 mm, mediolateral (M/L) = +/- 6,4 mm; B: A/P= -2,7 mm, M/L= +/- 6,4 mm; C: A/P= -2,7 mm, M/L= +/- 8,67 mm; D: A/P= -5,8 mm, M/L= +/- 8,67 mm. Senken Sie die Nadel nach rechts über das Schläfenbein, um jeden dieser vier Punkte zu visualisieren. Markieren Sie mit einem Filzstift die Punkte auf dem Schläfenbein und verbinden Sie sie, um ein Rechteck zu zeichnen. Das Rechteck dient als Leitfaden zum Öffnen eines Fensters im Knochen (Abbildung 1).

3. Chirurgische Exposition des AC

1. Öffnen Sie das Fenster mit einer elektrischen Bohrmaschine und einem kleinen Bohrer (0,6 mm Ø). Bohren Sie den Umfang des Rechtecks bei 8.000 U/min, bis der Knochen nachgibt. Kühlen Sie die Bohrfläche, indem Sie sie mit kalter, steriler Kochsalzlösung spülen, um eine Beschädigung der subkortikalen Strukturen zu vermeiden. Wenn der Knochen nachgibt, kann ein Abfall des Widerstands festgestellt werden. Achte darauf, das Gehirn nicht zu bohren.
2. Wenn die Ränder locker sind, ziehen Sie den Deckknochen mit einer feinen Pinzette nach oben und lagern Sie ihn in kalter, steriler Kochsalzlösung.

4. Ablation des AC

1. Schneiden Sie mit einem Operationsmikroskop (10X) die Hirnhäute vorsichtig mit einem mikrochirurgischen Messer ab und entfernen Sie sie mit zwei feinen Zangen. Wenn Blutungen auftreten, spülen Sie es mit kalter, steriler Kochsalzlösung aus.
2. Saugen Sie die Klimaanlage vorsichtig mit einem chirurgischen Absauggerät (Druck -0,24 bar) an, das mit einer sterilen 20-G-Nadel mit stumpfer Spitze gekoppelt ist. Dieser Punkt ist kritisch und muss sehr sorgfältig durchgeführt werden: Aspirieren Sie nur die sechs kortikalen Schichten und nicht die darunter liegende weiße Substanz.
3. Aspirieren, bis die perforierenden Arterien aufhören zu bluten.
4. Wenn die Aspiration abgeschlossen ist, bedecken Sie die verletzte Stelle mit dem extrahierten Knochen und tragen Sie eine resorbierbare hämostatische Gaze auf.
5. Lassen Sie den Schläfenmuskel seine ursprüngliche Position wiederherstellen und nähen Sie die Haut dann mit Wundklammern (9 mm). Tragen Sie eine antibiotische Salbe auf. Tragen Sie weiterhin drei Tage lang zweimal täglich Salbe auf die Wunde auf.
   HINWEIS: Jede Anwendung besteht aus einer dünnen Schicht, die auf die Wunde aufgetragen wird.
6. Injizieren Sie Buprenorphin subkutan in den Rücken der Ratte (0,05 mg/kg) als Analgetikum 1 h nach der Operation und dann alle 8 Stunden während 72 Stunden.
7. Lassen Sie das Tier auf dem Heizkissen, bis es aufwacht, und bringen Sie es zur Genesung in seinen Stallkäfig zurück.

Abbildung 1: Bilder des Schläfenbeins der Ratte in drei verschiedenen Operationsschritten. (A) Übertragung der stereotaktischen Koordinaten des AC auf das Schläfenbein. Die Koordinaten der vier Punkte sind: A: A/P= -5,8 mm, M/L= +/- 6,4 mm; B: A/P= -2,7 mm, M/L= +/- 6,4 mm; C: A/P= -2,7 mm, M/L= +/- 8,67 mm; D: A/P= -5,8 mm, M/L= +/- 8,67 mm. (B) Die Koordinaten werden als Referenz verwendet, um ein Rechteck auf der Oberfläche des Schläfenknochens zu zeichnen, das das Öffnen eines Fensters leitet. (C) Zeigt das Fenster an, das nach dem Bohren im Knochen geöffnet wurde. Die Hirnhäute mit Blutgefäßen können auf der Oberfläche des Gehirns beobachtet werden. R: rostral, D: dorsal.