Tag 1
1. Markierung der Mitochondrien der mesenchymalen Stammzelle (MSC)
- Zwei Tage vor der Mitochondrienvorbereitung humane MSCs in einer 100 mm cultAure-Schale in 10 ml (Minimum Essential Medium Eagle)/FBS (fetales Rinderserum) 10% aussäen, so dass an Tag 1 4 x 105 MSCs in Kultur vorhanden sind.
- MSCs mit PBS (4 ml) spülen und 4 ml αMEM/FBS 1 % (auf 37 °C vorgewärmt) zugeben.
- Geben Sie die benötigte Menge Mitochondria Vital Dye hinzu und inkubieren Sie die Zellen für 30 min im 37 °C Inkubator.
- Entfernen Sie die Mitochondrien-Farbstofflösung, spülen Sie die Zellen zweimal mit 4 ml vorgewärmten (37 °C) αMEM/FBS 1% und fügen Sie 4 ml αMEM/FBS 10% wieder hinzu. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C.
- Wechseln Sie das Kulturmedium (10 ml αMEM/FBS 10 %) nach 30 Minuten und ein weiteres Mal 2 Stunden später.
Tag 1
2. Markierung der Glioblastom-Stammzellen (GSC)
- Dissoziieren Sie GSCs Gb4-Zelllinie (10 x 106 Zellen), gezüchtet als Neurosphären auf Poly-HEMA-beschichteten Zellkulturflaschen
- GSCs in einer 48-Well-Platte mit 105 Zellen/Well in GSC-Proliferationsmedium (500 μl) aussäen (siehe Tabelle 1).
- Die Platte bei 270 x g für 5 min bei 20 °C zentrifugieren.
- Die erforderliche Menge des zellvitalen Farbstoffs zugeben und 30 min bei 37 °C inkubieren.
- 500 μl GSC-Basalmedium (Tabelle 1) pro Vertiefung der 48-Well-Platte hinzufügen.
- Die Platte bei 270 x g bei 20 °C 5 min zentrifugieren. Aspirieren Sie den Überstand.
- Wiederholen Sie die Schritte 2.5 bis 2.6.
- 500 μl GSC-Basalmedium zugeben und 30 min bei 37 °C inkubieren.
- Die Platte bei 270 x g bei 20 °C 5 min zentrifugieren. Aspirieren Sie den Überstand.
- Geben Sie 500 μl GSC-Proliferationsmedium pro Vertiefung der 48-Well-Platte hinzu und inkubieren Sie im 37 °C-Inkubator.
Hinweis: Die angegebene Menge an GSCs (10 x 106 Zellen) ermöglicht die Durchführung der verschiedenen Dosis-Wirkungs-Experimente und FACS-Kontrollen. Sobald die Versuchsbedingungen genauer definiert sind, kann dieser Betrag verkleinert werden.
3. Aussaat von Glioblastom-Stammzellen
- Sammeln Sie die GSC-Neurosphären (Glioblastom-Stammzellen) (10 x 106 Zellen) durch Zentrifugation bei 270 x g für 5 min, bei 20 °C in einem 50 ml Röhrchen.
- Die Zellen mit 5 ml HBSS (Hanks' Balanced Salt Solution) waschen und bei 270 x g für 5 min bei 20 °C zentrifugieren.
- Aspirieren Sie den Überstand.
- Resuspendieren Sie das GSC-Pellet vorsichtig in 100 μl Trypsin-EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure) (0,25%) (pro 10 x 106 Zellen)
- Bei 37 °C 3 Min. inkubieren.
- 10 μl CaCl2 (20 mM) und 2 μl DNase I (10 mg/ml) zugeben.
- Dissoziieren Sie die Neurosphären, indem Sie mit einer P200-Pipette vorsichtig auf und ab pipettieren (30-50x). Vermeiden Sie Blasen. Überprüfen Sie unter dem Mikroskop, ob alle GSCs dissoziiert sind.
- Fügen Sie 10 μl Trypsin-Inhibitor (5%) und 10 ml HBSS hinzu.
- GSCs bei 270 x g für 7 min bei 20 °C zentrifugieren.
- Den Überstand verwerfen und 10 ml GSC-Basalmedium hinzufügen.
- GSCs mit einer Thoma-Zählkammer zählen und dann die Zellen bei 270 x g für 7 min bei 20 °C zentrifugieren.
- Das entsprechende Volumen des GSC-Proliferationsmediums wird zugegeben, um die zelluläre Konzentration von 106 GSCs/ml zu erreichen.
- 105 GSCs (100 μl der Zellsuspension) pro Vertiefung einer 96-Well-Platte aussäen.
- Zentrifugieren Sie die Platten bei 270 x g für 7 min bei 20 °C, um GSCs am Boden der Vertiefungen zu erhalten.
- Inkubieren Sie die 96-Well-Platte bei 37 °C.
Tag 2
4. MSC (mesenchymale Stammzellen) Isolierung der Mitochondrien
- Stellen Sie die Temperatur der Mikroröhrchenzentrifuge auf 4 °C ein.
- Bereiten Sie zwei 1,5-ml-Röhrchen "A" und "C" vor, die die Reagenzien für die Mitochondrienextraktion enthalten (200 μl Reagenz A und 400 μl Reagenz C, beide mit den EDTA-freien Proteaseinhibitoren). Bereiten Sie 2 weitere Röhrchen vor, die mit "MSC" und "Mito" beschriftet sind. Halten Sie alle Röhren auf Eis. Bereiten Sie auch Röhrchen für die seriellen Verdünnungen der Mitochondrien vor.
- MSCs mit 10 ml vorgewärmter (37 °C) PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung) waschen.
- MSCs 10 Sekunden lang mit 2 ml Trypsin (kein EDTA) waschen und 1 ml Trypsin (kein EDTA) hinzufügen. Inkubieren Sie die Zellen 5-10 Minuten lang bei 37 °C.
- Die MSCs werden durch Zugabe von 10 ml αMEM /FBS 10 % zurückgewonnen und in ein 50-ml-Röhrchen umgefüllt.
- Zellen bei 270 x g für 5 min bei 20 °C zentrifugieren.
- Der Überstand wird verworfen und 10 ml αMEM/FBS 10 % zum Zellpellet gegeben.
- Zählen Sie die MSCs mit einer Malassez-Zählkammer.
- MSCs (4-5 x 105) bei 270 x g für 5 min bei 20 °C zentrifugieren.
- Der Überstand wird entsorgt, 1 m eiskaltes αMEM/FBS 10 % zum Zellpellet gegeben und die Zellen in das mit "MSC" markierte Röhrchen überführt. Halten Sie die Tube auf Eis.
- Das Röhrchen mit den MSC bei 900 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren.
- Entfernen Sie alle Medienreste aus dem Rohr.
- Fügen Sie 200 μl Mitochondrien-Isolationsreagenz A hinzu (enthält die EDTA-freien Proteaseinhibitoren). Bei mittlerer Geschwindigkeit 5 Sek. lang vortexen und die Röhren genau 2 Min. auf Eis liegen lassen.
- 2,5 μl Mitochondria Isolation Reagenz B. Vortex bei maximaler Geschwindigkeit für 10 Sekunden zugeben und dann die Röhrchen auf Eis stehen lassen. Alle 30 Sekunden für 5 Minuten wiederholen.
- 200 μl Mitochondrien-Isolationsreagenz C (enthält die EDTA-freien Proteasehemmer) zugeben. Mixen Sie, indem Sie das Röhrchen kippen (ca. 30 Mal, nicht vortexen). Das Röhrchen bei 700 x g für 10 min bei 4 °C zentrifugieren.
- Übertragen Sie den Überstand (mit den MSC-Mitochondrien) in das "Mito"-Röhrchen.
- Zentrifugieren Sie bei 3.000 x g, 15 min bei 4 °C, um das Mitochondrien-Pellet zu erhalten. Entsorgen Sie den Überstand. Das Pellet enthält die isolierten Mitochondrien.
- Spülen Sie das Mitochondrien-Pellet mit 200 μl des Reagenzes C aus. Zentrifugieren Sie dann bei 12.000 x g, 5 min bei 4 °C, um das Mitochondrien-Pellet zu erhalten.
5. Übertragung von isolierten MSC-Mitochondrien auf GSCs (MitoCeption)
- Geben Sie 200 μl des vorgekühlten (0 °C) GSC-Proliferationsmediums zu dem aus MSCs isolierten Mitochondrienpellet (4 x 105).
- Verdünnen Sie das Mitochondrienpräparat (in GSC-Proliferationsmedium), um den GSCs konsistent 20 μl mitochondriale Suspension zuzusetzen.
- Das Volumen der isolierten Mitochondrien wird in der gewünschten Konzentration (0,1 bis 10 μg) in die Vertiefungen der 96-Well-Platte mit den GSCs gegeben. Fügen Sie die Mitochondrien langsam in der Nähe des Bodens der Vertiefung hinzu und bedecken Sie mindestens einmal die gesamte Oberfläche.
- Die 96-Well-Platte, die die Mitochondrien-Empfänger-GSCs enthält, wird mit den MSC-Mitochondrien und die Kontrollplatte bei 1.500 x g für 15 min bei 4 °C zentrifugiert.
- Legen Sie die Kulturplatten unmittelbar nach der Zentrifugation in den 37 °C heißen Zellinkubator.
Hinweis: Das Mitochondrientransferprotokoll beruht auf der Zentrifugation der Mitochondriensuspension auf den kultivierten Zellen bei der adäquaten Zentrifugationskraft, mit einer Anzahl von Zentrifugen, die je nach System der Mitochondrien-Spender-/Empfängerzellen angepasst werden können.
Tabelle 1: Nährmedien.
| Zellkulturmedium | Zusammensetzung |
| GSC-Basalmedium | DMEM/F-12 ergänzt mit |
| Insulin 20 mg/ml |
| N2 Ergänzung 1x |
| Glukose 3 g/L |
| L-Glutamin 2 mM |
| GSC-Proliferationsmedium | Zum Basalmedium hinzufügen: |
| B27 Beilage 1x |
| EGF 10 ng/ml |
| bFGF 10 ng/ml |
| Pilze 10 mg/ml |
| Fungizone 0,25 mg/ml |
| Heparin 2 mg /ml |
| Ciprofloxacin 2 μg / ml |
| Gentamicin 2 μg/ml |
| MSC-Proliferationsmedium | αMEM ergänzt mit |
| L-Glutamin 2 mM |
| 10 % FBS |
| bFGF 2 ng/ml |
