Fluoreszenzfärbung von Neuralleistenzellen, die auf Hydrogelen unterschiedlicher Steifigkeit kultiviert wurden

Zusammenfassung

Quelle: Le, T. P., et al., Ein optimiertes O9-1/Hydrogel-System zur Untersuchung mechanischer Signale in Neuralleistenzellen. J. Vist. Exp. (2021)

In diesem Video beschreiben wir das Verfahren zur Durchführung einer Fluoreszenzfärbung mittels Fluoreszenzmikroskopie, um die Phalloidinfärbung von Neuralleistenzellen zu demonstrieren, die auf Hydrogelen unterschiedlicher Steifigkeit kultiviert wurden, um die Organisation des Zytoskeletts sichtbar zu machen und zu analysieren.

Protokoll

1. Molekulare Analyse der Steifigkeit mittels Immunfluoreszenzfärbung

1. Transportieren Sie das Deckglas mit einer Pinzette auf eine neue Platte, um falsche Signale von Zellen, die direkt auf die Platte gewachsen sind, zu minimieren. Waschen Sie die Zellen dreimal mit 500 μl sterilem PBS, um abgestorbene Zellen und restliches Kulturmedium zu entfernen.
2. Fixieren Sie die Zellen mit ungestörten 500 μl 4%igem Paraformaldehyd (PFA) für 10 min bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Zellen dann dreimal erneut mit 500 μl PBS/Vertiefung für jeweils 2 Minuten.
   HINWEIS: Bei 4 °C für einen Verfahrensstopp lagern.
3. Behandeln Sie die Zellen mit 500 μl 0,1 % Triton X-100 für 15 min bei Raumtemperatur. Waschen Sie dann die Zellen dreimal mit 500 μl PBS/Well.
4. Blockieren Sie die Zellen mit 250 μl 10 % Eselserum (verdünnt in PBS und 0,1 % Tween 20) pro Vertiefung für 30 Minuten bei Raumtemperatur.
5. Inkubieren Sie die Zellen mit Phalloidin, das für die F-Aktin-Färbung verwendet wird, in einer Verdünnung von 1:400 in 250 μl 10%igem Eselsserum für 30 min bei Raumtemperatur. Waschen Sie dann die Zellen dreimal mit PBS für jeweils 5 Minuten.
   HINWEIS: 568 nm Phalloidin kann mit 488 nm oder 647 nm Sekundärantikörpern oder allein inkubiert werden.
6. Inkubieren Sie die Zellen mit 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI, 1:1000 Verdünnung) in 250 μl PBS für 10 min, gefolgt von einer letzten Wäsche PBS für 2 min.
7. Geben Sie 3-4 Tropfen Eindeckmittel in jede Vertiefung. Lagern Sie die Proben vor der Bildgebung mindestens 2 Stunden lang bei 4 °C, um sicherzustellen, dass das Eindeckmedium richtig eingestellt wurde.
8. Nehmen Sie mit einem Fluoreszenzmikroskop Bilder von mindestens 3 zufälligen Bildern pro Hydrogelprobe auf, wodurch einzelne und verschmolzene Kanäle erzeugt werden.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
2 mm #1 Corning 0211 Glas-Deckglas	Chemglass Biowissenschaften	CLS-1763-012
25 mm #1 Corning 0211 Glas-Deckglas	Chemglass Biowissenschaften	CLS-1763-025
Zellkulturplatte mit 4 Vertiefungen	Thermo Scientific	179830
4% Paraformaldehyd	Sigma Aldrich	J61899-AP
40% Acrylamid	Sigma Aldrich	Nr. A4058
Alexa Fluor 488 Phalloidin	Thermo-Fischer	Nr. A12379
Kollagen Typ I (100mg)	Corning	354236
DAPI (4',6-Diamidino-2-phenylindol, Dihydrochlorid)	Thermo-Fischer	D1306
Eselserum	Sigma Aldrich	D9663
Steril 1x PBS	Hyclone	SH30256.02
Fluoreszenzmikroskop	Leica