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Alle Verfahren, bei denen Tierproben verwendet werden, wurden von der zuständigen Kommission für die ethische Überprüfung der Tiere überprüft und genehmigt.
1. Vorbereitung der Arbeitslösungen und Puffer
HINWEIS: Bereiten Sie am Morgen des Assays die folgenden Lösungen vor. Diese Berechnung basiert auf den notwendigen Lösungen, um zwei Hirnregionen (d.h. den präfrontalen Kortex [PFC] und den Hippocampus [HPC]) von 12 Mäusen zu bearbeiten.
- Bereiten Sie künstliche Zerebrospinalflüssigkeit (aCSF, pH = 7,4) vor, wie in Tabelle 1 beschrieben. Geben Sie 750 μl aCSF in jedes Probenahmeröhrchen und legen Sie sie in den Metalltemperaturblock auf Eis, um den Puffer vorzukühlen.
- Bereiten Sie den Lysepuffer vor, wie in Tabelle 2 beschrieben. Auf Eis lagern (400 μl pro Probe).
- Bereiten Sie eine 52 mM Bis(sulfosuccinimidyl)suberat oder BS3-Stammlösung (26x) in 5 mM Natriumcitratpuffer (pH = 5,0) vor.
- Bereiten Sie zunächst 100 mM Zitronensäure (Stamm A) und 100 mM Natriumcitrat (Stamm B) vor.
- Stamm A und Stamm B im Verhältnis 1:20 mit entionisiertem Wasser verdünnen. Jeweils 100 μl auf 1,9 ml Wasser geben, um 5 mM Zitronensäure (Stamm C) bzw. 5 mM Natriumcitrat (Stamm D) herzustellen.
- Mischen Sie 410 μl Stamm C und 590 μl Stamm D, um einen 5 mM Natriumcitratpuffer (pH = 5,0) herzustellen (Lösung E, 1 mL).
- Bestätigen Sie den pH-Wert von Lösung E mit einem pH-Indikatorstreifen.
- 24 mg BS3 werden in 806,4 μl Lösung E gelöst, indem 30 s lang vortext werden, um die BS3-Stammlösung (26x) herzustellen.
- Bereiten Sie weitere 1 ml Lösung E vor, die als Vehikelkontrolle für die nicht vernetzenden Proben verwendet wird.
HINWEIS: Bereiten Sie BS3-Stammlösung vor, wenn alles andere fertig ist und das Experiment gleich beginnt. Der BS3 sollte bis zur Verwendung getrocknet bei 4 °C gelagert werden. Nach der Rekonstitution bleibt BS3 nur etwa ≤3 h aktiv. Da Berichten zufolge der pH-Wert des 5 mM Natriumcitratpuffers (Lösung E) im Laufe der Zeit ansteigt, was zu einer beschleunigten BS3-Hydrolyse führt, wird empfohlen, Lösung E frisch aus den Stammlösungen A und B herzustellen. Aufgrund der begrenzten Löslichkeit von BS3 bei niedrigen Temperaturen sollte das rekonstituierte BS3 bei RT aufbewahrt werden. Das rekonstituierte BS3 ist innerhalb von 3 h zu verwenden. und frieren/tauen Sie das rekonstituierte BS3 nicht ein und verwenden Sie es nicht wieder.
2. Sektion von Hirngewebe
HINWEIS: Von diesem Schritt an sollten mindestens zwei Personen koordiniert zusammenarbeiten. Während sich die eine Person auf die Tiersektion konzentriert, sollte die andere Person als Zeitnehmer fungieren und bei der Koordination des Assays helfen.
- Bringen Sie das erste Tier zum Sezieren aus dem Stallbereich in den Sezierraum.
HINWEIS: Da akute Stressoren (z.B. eine neue Umgebung, der Blutgeruch) die Proteindynamik des Gehirns beeinflussen können, sollten die Tiere in ihren häuslichen Käfigen gehalten werden, die weit vom Sezierbereich entfernt sind, und dann einzeln in den Sezierraum gebracht werden, um sofort enthauptet zu werden.
- Euthanasieren Sie die Maus durch Zervixluxation, gefolgt von Enthauptung. Entfernen Sie das Gehirn schnell aus dem Schädel und tauchen Sie es für 10-15 s in eiskaltes PBS in eine Petrischale (Abbildung 1).
HINWEIS: Die Tiere werden für BS3-Experimente nicht betäubt, da jedes Anästhetikum möglicherweise das Oberflächenpräsentationsniveau der Neurotransmitterrezeptoren beeinflussen könnte.
- Platzieren Sie das gekühlte Gehirn in der Gehirnmatrix auf Eis, mit der ventralen Seite des Gehirns nach oben (Abbildung 2).
- Führen Sie die erste Rasierklinge durch die Grenze zwischen dem Riechkolben und dem Riechstiel, um das Gehirn koronal zu schneiden (Abbildung 3). Schneiden Sie mit drei bis vier zusätzlichen Rasierklingen den vorderen Teil des Gehirns seriell in Abständen von 1 mm koronal ab.
- Heben Sie die koronalen Scheiben von der Gehirnmatrix ab, indem Sie alle eingeführten Rasierklingen zusammenhalten und den hinteren Teil des Gehirns in der Gehirnmatrix zurücklassen. Trennen Sie die Rasierklingen mit einer Pinzette voneinander und legen Sie sie mit der Hirnscheibe nach oben auf die flache, gekühlte Oberfläche (Abbildung 4).
- Identifizieren Sie die Segmente, die den interessierenden Bereich enthalten. Wählen Sie für die Probenahme des PFC die zweite und dritte Scheibe hinter der ersten Scheibe mit dem Riechstiel.
- Entfernen Sie den interessierenden Bereich mit einer Gewebestanze, legen Sie ihn auf die gekühlte Rasierklinge und teilen Sie das Gewebe gleichmäßig in zwei Teile (z. B. Gewebe aus der linken und rechten Hemisphäre, wobei eine Hälfte für die BS3-Vernetzungsreaktion und die andere Hälfte für die No-Crosslinking-Kontrolle verwendet wird, wenn das Zielprotein von Interesse in beiden Hemisphären gleich exprimiert wird).
- Zerkleinern Sie jedes Taschentuch auf der Rasierklinge mit der feinen Spitze der Pinzette in Stücke, indem Sie mehrere vertikale Bewegungen gegen die Klinge ausführen, anstatt das Gewebe zu zerdrücken oder zu mahlen. Dadurch wird die für BS3 zugängliche Oberfläche maximiert, ohne die Membranintegrität der Zellen stark zu beeinträchtigen. Unmittelbar nach dem Zerkleinern werden die zerkleinerten Gewebe in die entsprechenden Röhrchen überführt (siehe Schritt 3.3).
3. Vernetzungsreaktion
- Bringen Sie das nächste Tier zum Sezieren aus dem Stallbereich in den Sezierraum, wenn die Präparierung des Gehirns der vorherigen Maus kurz vor dem Abschluss steht (Schritt 2.10).
- Spiken Sie das auf Eis vorgekühlte Röhrchen mit 30 μl BS3-Lösung (26x) oder Vehikellösung E, kurz bevor das zerkleinerte Gewebe bereit ist, in die entsprechenden Röhrchen umgefüllt zu werden. Wechseln Sie die Pipettenspitzen zwischen den Röhrchen, um sicherzustellen, dass kein BS3 in den nicht vernetzenden Kontrollröhrchen kontaminiert ist.
- Übertragen Sie das zerkleinerte Gewebe (aus Schritt 2.8) in die entsprechenden Röhrchen und beginnen Sie dann mit der Präparierung des nächsten Tieres (Schritt 2.2).
- Drehen Sie das Röhrchen um und mischen Sie es, um die Gewebestücke in kleinere Stücke zu zerlegen, und beginnen Sie, die Proben auf dem Röhrchenrotator im Kühlraum für 30 Minuten bis 2 Stunden zu inkubieren. Notieren Sie die Startzeit der BS3-Inkubation für jedes Röhrchen. Siehe den Diskussionsabschnitt für die optimale Inkubationszeit.
- Quenden Sie die Reaktion ab, indem Sie das Röhrchen mit 78 μl 1 M Glycin spießen und die Probe 10 Minuten lang bei 4 °C mit konstanter Rotation inkubieren. Notieren Sie die Start- und Endzeit des Abschreckens für jedes Röhrchen. Unterstützen Sie die Person, die sich auf die Tiersektion konzentriert, weiter, indem Sie das nächste Tier bringen (Schritt 3.1) und beim Crosslinking helfen (Schritt 3.2).
HINWEIS: Behandeln Sie jede Probe genau zur gleichen Zeit für alle Proben. Wenn der Sezierraum weit vom Kühlraum entfernt ist, wird dringend empfohlen, eine dritte Person zu rekrutieren, die an der Probeninkubation und dem Abschrecken im Kühlraum teilnimmt.
Tabelle 1: Die Zusammensetzung des künstlichen Liquors.
| Arbeitskonz. | Stammlösung | Menge der abzugebenden Stammlösung |
| 1,2 mM CaCl2 | 480 mM (400x)* | 100 μL |
| 20 mM HEPES | 1 M (50-fach) | 800 μL |
| 147 mM NaCl | 5 M (34x) | 1176,5 μL |
| 2,7 mM KCl | 1,08 M (400x) | 100 μL |
| 1 mM MgCl2 | 400 mM (400x) | 100 μL |
| 10 mM Glukose | 2,5 M (250x) | 160 μL |
| Deionisiertes Wasser | | 37.563 ml |
| Gesamt | | 40 ml |
| * CaCl2-Stamm sollte am Tag des Experiments frisch zubereitet werden. |
Tabelle 2: Die Zusammensetzung des Lysepuffers
| Arbeitskonz. | Stammlösung | Menge der abzugebenden Stammlösung |
| 25 mM HEPES | 1 M (40x) | 500 μL |
| 500 mM NaCl | 5 M (10-fach) | 2 ml |
| 2 mM EDTA | 0,5 M (250x) | 80 μL |
| 1 mM DVBV | 1 M (1000x) | 20 μL |
| 0,1 % NP-40 | 10% (100x) | 200 μL |
| Proteasehemmer Cocktail | 100x | 200 μL |
| Deionisiertes Wasser | | 17 ml |
| Gesamt | | 20 ml |
