Beurteilung der Glukoseaufnahme in den Motoneuronen von Drosophila-Larven mit hochreguliertem Glukosestoffwechsel

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Quelle: Loganathan, S., et al., Messung der Glukoseaufnahme in Drosophila Modellen der TDP-43-Proteinopathie. J. Vis. exp. (2021).

Das Video demonstriert eine Technik zur Messung der Glukoseaufnahme in Drosophila larvalen Motoneuronen unter Verwendung eines intrazellulären Glukosesensors auf Basis des Fluoreszenzresonanz-Energietransfers (FRET). Nach dem Präparieren der Larven, um den ventralen Nervenstrang freizulegen, werden die Motoneuronen durch die Fluoreszenz sichtbar, die vom Donorfluorophor des Sensors emittiert wird. Bei Stimulation mit Glukose löst FRET zwischen den Donor- und Akzeptor-Fluorophoren des Sensors die Emission von Fluoreszenz aus dem Akzeptor aus, was den Vergleich der Glukoseaufnahme zwischen Kontrolllarven und mutierten Larven mit hochreguliertem Glukosestoffwechsel ermöglicht.

Protokoll

1. Drosophila Sektionen des ventralen Nervenstrangs (VNC)

Stellen Sie Sezierschalen aus Silikonelastomer her.
1. Silikonelastomerkomponenten wie im Herstellerprotokoll angegeben in ein 50-ml-Röhrchen geben und gut umrühren.
2. Füllen Sie 35-mm-Gewebekulturschalen mit ca. 2 mL der Elastomermischung. Verwenden Sie eine Spritze, um Blasen zu entfernen. Decken Sie die Schalen ab und stellen Sie sie über Nacht auf eine ebene Fläche in den 60 °C heißen Ofen, damit sie aushärten.
Deseziere Drosophila Larven, um das VNC freizulegen und gleichzeitig die Lebensfähigkeit des Gewebes zu erhalten.
1. Sammeln Sie eine wandernde Larve im dritten Stadium, spülen Sie sie mit ddH₂O und legen Sie sie dann in einen Tropfen Hemolymph-like 3 (HL3)-Puffer (70 mM NaCl, 5 mM KCl, 20 mM MgCl₂, 10 mM NaHCO₃, 115 mM Saccharose, 5 mM Trehalose, 5 mM Hydroxyethylpiperazin-Ethansulfonsäure [HEPES]; pH 7,1) auf eine mit Elastomer ausgekleidete Schale.
2. Stecken Sie mit einer Pinzette (Pinzette #5 oder 55) unter einem Präpariermikroskop das vordere und hintere Ende der Rückenseite der Larve nach oben und dehnen Sie die Larve vorsichtig mit Insektennadeln (Minutein Pins) in Längsrichtung.
3. Machen Sie einen Schnitt direkt über dem hinteren Stift mit einer abgewinkelten Irisschere. Machen Sie einen vertikalen Schnitt beginnend vom Schnitt zum vorderen Ende der Larve.
4. Fügen Sie bei Bedarf einige Tropfen HL-3-Puffer hinzu. Entfernen Sie die Luftröhre und den Rest der Schwimmorgane, ohne das Zentralnervensystem (ZNS) zu stören. Stecken Sie die Lappen fest, die die Körperwand dehnen, um das ZNS freizulegen, während das neuromuskuläre System (VNCs, Axone und neuromuskuläre Verbindungen) intakt bleibt.

2. Bilderbuchung

Optimieren Sie die Bildgebungsparameter.
1. Schalten Sie das Mikroskop und die Laser ein, bevor Sie mit der Sektion beginnen. Die Bilder müssen mit einem aufrechten konfokalen Mikroskop mit einer 40-fachen Wasserimmersionslinse aufgenommen werden. Verwenden Sie einen 405-nm-Laser, um das cyanfarbene fluoreszierende Protein (CFP) anzuregen, und erfassen Sie die Bilder sowohl im CFP- (465-499 nm) als auch im FRET-Detektionskanal (535-695 nm).
2. Optimieren Sie Erfassungsparameter wie Scangeschwindigkeit (6), Durchschnitt (2), Objektiv (40x), Zoom (1x), Lochblendengröße (1 AU) und räumliche Auflösung (512 x 512). Stellen Sie die Verstärkung so ein, dass sich das Signal im optimalen Dynamikbereich befindet. Für alle Genotypen müssen die gleichen Parameter verwendet werden.
Bilden Sie Motoneuronen im VNC ab.
1. Legen Sie die Silikonschale mit der präparierten Probe unter die Linse. Senken Sie die Linse so ab, dass sie mit Trehalose-Saccharose HL3-Puffer in Kontakt kommt. Es ist wichtig sicherzustellen, dass das Objektiv vollständig in den Puffer eingetaucht ist. Fügen Sie bei Bedarf mehr Puffer hinzu.
2. Verwenden Sie die CFP- und FRET-Kanäle, um manuell einen optischen Abschnitt auszuwählen, der aus mindestens 6 fokussierten Motoneuronen besteht, die sich entlang der VNC-Mittellinie befinden. Die Identifizierung der Motoneuronen erfolgt anhand der Expression des Glukosesensors und der Position entlang der anterior-posterioren Achse.
3. Erfassen Sie Bilder alle 10 s für 10 Minuten. Diese Bilder stellen die Grundlinie dar.
Stimulieren Sie mit Glukose angereichert HL-3.
1. Entfernen Sie die Trehalose-Saccharose, die HL3-Puffer enthält, mit einer Pasteur-Pipette und ersetzen Sie sie durch 5 mM Glukose supplementiertes HL-3 (70 mM NaCl, 5 mM KCl, 20 mM MgCl₂, 10 mM NaHCO₃, 115 mM Saccharose, 5 mM Glukose, 5 mM HEPES, pH 7,1). Dieser Schritt muss mit großer Sorgfalt durchgeführt werden, um die Bewegung des VNC so weit wie möglich zu vermeiden.
2. Nehmen Sie weitere 10 Minuten lang alle 10 s Bilder auf. Diese Bilder stellen die Stimulationsphase dar.
Speichern Sie die Bilder als .czi-Dateien oder einen beliebigen Dateityp, der von der Bildgebungssoftware unterstützt wird, mit einem Dateinamen, der das Datum, den genetischen Hintergrund, die experimentellen Bedingungen (Ausgangswert oder Stimulation) und die verwendeten Kanäle enthält.
Verwenden Sie die Parameter wieder, um alle Genotypen abzubilden (Abbildung 1A).

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Ergebnisse

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Abbildung 1: Bildanalyse eines Glukosesensors im Kontext einer TDP-43-Mutante. (A) Repräsentative Bilder von FRET- und CFP-Signalen in Glukosesensorkontrollen und TDP-43^G298S-Proben unter Ausgangs- und Stimulationsbedingungen. In jedem Bild ist ein repräsentatives Motoneuron als Beispiel für einen ROI dargestellt. Maßstabsbalken: 20 μm. Vergrößerung: 40x. (B