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Alle Verfahren mit Tierproben wurden von der zuständigen Kommission für ethische Überprüfung der Tiere überprüft und genehmigt.
1. Immunfärbung
HINWEIS: Führen Sie alle Waschungen und Inkubationen auf einem orbitalen Plattformschüttler durch, der auf ca. 100 U/min eingestellt ist. Alle Schritte werden bei Raumtemperatur durchgeführt, mit Ausnahme der Primärantikörper-Inkubation, die bei 4 °C durchgeführt wird. Bereiten Sie das Einbettmedium im Voraus vor, indem Sie die Zutaten in einem 50-ml-Röhrchen kombinieren und über Nacht in einem Nutator mischen. Vor Licht schützen und bis zu 2 Monate bei 4 °C lagern. Wenn das endogene Fluoreszenzsignal für die Bildgebung und Analyse ausreicht, ohne dass eine Immunfärbung erforderlich ist, können die Schritte 1.1-1.9 übersprungen werden. Wenn Sie die Immunfärbung überspringen, führen Sie drei 10-minütige Waschungen bei TBS durch und fahren Sie mit Schritt 1.10 fort.
- Bereiten Sie eine frische TBST-Lösung (0,2 % Triton in TBS) vor, indem Sie 1 ml 10 % Triton-X in ein 50-ml-Röhrchen geben und das Röhrchen auf 50 ml mit 1x TBS füllen. Bereiten Sie 2 ml Blockierungs- und Antikörperlösungen (10 % Ziegenserum in TBST) für jedes Gehirn vor.
HINWEIS: Um optimale Ergebnisse zu erzielen, stellen Sie für jedes neue Färbeexperiment frisches TBST her und verwenden Sie eine hochwertige Quelle aus 10 % wässrigem Triton-X (Table of Materials).
- Beschriften Sie eine 24-Well-Platte gemäß dem Schaltplan (Abbildung 1). Platzieren Sie verschiedene Proben in verschiedenen Reihen und unterschiedliche Lösungen in verschiedenen Spalten. Fügen Sie 1 ml TBST zu den ersten drei Spalten ("Wash 1", "Wash 2" und "Wash 3") hinzu. Geben Sie 1 ml Blockierungslösung in die vierte Spalte.
- Bereiten Sie ein Glasplektrum vor, indem Sie das Ende einer 5,75-Pasteur-Pipette mit einem Bunsenbrenner zu einem kleinen Haken schmelzen. Verwenden Sie dieses Plektrum, um Gewebeschnitte von der 12-Well-Platte in die Waschsäule 1 der 24-Well-Platte zu übertragen.
HINWEIS: Um optimale Ergebnisse zu erzielen, sieben Sie die Abschnitte, bevor Sie mit dem Färben beginnen. Um die Schnitte zu screenen, übertragen Sie die Schnitte nacheinander in eine mit 1x TBS gefüllte Petrischale und untersuchen Sie die Schnitte mit einem Fluoreszenzmikroskop mit einem 5x- oder 10x-Objektiv, um sicherzustellen, dass eine ausreichende Anzahl fluoreszenzmarkierter Zellen vorhanden ist. Es wird empfohlen, vier bis sechs Abschnitte pro Vertiefung zu färben, obwohl bei Bedarf bis zu acht pro Vertiefung angefärbt werden können.
- Waschen Sie die Abschnitte jeweils 10 Minuten lang in den Vertiefungen 1, 2 und 3 und inkubieren Sie sie anschließend 1 Stunde lang in der Blocklösung. Verwenden Sie das Glaspickel, um die Abschnitte von einer Vertiefung in die nächste zu übertragen. Mit dem Plektrum können mehrere Gehirnabschnitte auf einmal übertragen werden.
- Bereiten Sie 1 ml Primärantikörperlösung für jede Probe vor (z. B. Kaninchen RFP 1:2000 oder Huhn GFP 1:2000). Den Antikörper in die Antikörperlösung geben, kurz vortexen und dann 5 min bei ≥ 4.000 x g bei 4 °C zentrifugieren. Die Abschnitte im Primärantikörper zwei bis drei Nächte bei 4 °C unter Schütteln inkubieren.
- Nach der Inkubation des primären Antikörpers aspirieren Sie das Tag-1-TBST aus den Waschvertiefungen, fügen Sie 1 ml neues TBST in jede Waschvertiefung hinzu und verschieben Sie die Abschnitte in die erste Waschvertiefung. Waschen Sie die Abschnitte 3x für jeweils 10 min.
HINWEIS: Verwenden Sie zum Absaugen eine 9-Zoll-Pasteurpipette, die mit einem Schlauch an einen Isolierkolben angeschlossen ist. Als Vakuumquelle können Hausvakuumleitungen oder eine elektrische Vakuumpumpe verwendet werden.
- Während die Schnitte gewaschen werden, bereiten Sie sekundäre Antikörperlösungen in einer Konzentration von 1:200 vor, indem Sie der Antikörperlösung Antikörper zusetzen (z. B. Ziegen-Anti-Kaninchen 594 oder Ziegen-Anti-Huhn 488). Kurz vortexen und dann 5 Minuten lang bei ≥ 4.000 x g bei 4 °C drehen.
- Die Abschnitte werden 3 h lang bei Raumtemperatur in Sekundärantikörpern inkubiert. Schützen Sie die Schnitte während dieses und aller folgenden Schritte vor Licht, um das Ausbleichen der Sekundärantikörper zu mildern.
- Nach der Inkubation mit sekundären Antikörpern aspirieren Sie das Tag-2-TBST aus den Waschvertiefungen, fügen Sie 1 ml neues TBST zu jeder Waschvertiefung hinzu und verschieben Sie die Abschnitte in die erste Waschvertiefung. Die Abschnitte 3x in TBST für je 10 min waschen.
- Nehmen Sie das Eindeckmedium bei der letzten Wäsche aus 4 °C heraus und lassen Sie es auf Raumtemperatur erwärmen. Bereite eine 2:1 Mischung aus 1x ELS:destilliertem Wasser zu und gib diese in eine Petrischale. Bereiten Sie einen Objektträger vor, indem Sie 800 μl 2:1 TBS:dH2O auf die Oberfläche geben.
HINWEIS: Die Verwendung von nicht aushärtenden Einbettmedien wird dringend empfohlen. Das Aushärten von Einbettmedien kann das Volumen des Gewebes verändern, was die Analyse des Volumens des Astrozytenterritoriums verwirren kann. Ein Rezept für ein einfaches und preiswertes selbstgemachtes Eindeckmedium finden Sie in der Table of Materials.
- Übertragen Sie die Abschnitte mit einem feinen Pinsel nacheinander aus der Vertiefung Wash 3 in die Petrischale. Dieser Schritt entfernt das Triton und hilft dabei, die Abschnitte abzuflachen. Übertragen Sie als nächstes die Abschnitte aus der Petrischale in die Flüssigkeit auf dem Objektträger.
- Verwenden Sie einen Pinsel, um die Abschnitte so anzuordnen, dass sie flach auf der Folie liegen. Entfernen Sie vorsichtig überschüssige Flüssigkeit mit einer P1000-Pipette aus dem Objektträger, gefolgt von einer Vakuumaspiration.
HINWEIS: Fügen Sie eine P200-Pipettenspitze am Ende der Pasteurpipette hinzu, um die Vakuumaspiration feiner zu steuern.
- Sobald die überschüssige Flüssigkeit vom Objektträger entfernt wurde, verwenden Sie eine Transferpipette, um sofort einen Tropfen Montagemedium auf jeden Abschnitt zu geben, und legen Sie vorsichtig ein Deckglas über den Objektträger. Lassen Sie das Eindeckmedium einige Minuten lang ausbreiten, und entfernen Sie dann überschüssige Einbettmedien, die unter dem Deckglas hervortreten, durch Vakuumaspiration.
HINWEIS: Lassen Sie die Abschnitte nicht trocknen, bevor Sie das Montagemedium hinzufügen. Wenn die Schnitte vor der Zugabe von Einbettmedien zu trocknen beginnen, kann dies das Gewebevolumen beeinträchtigen und eine genaue Datenerfassung erschweren.
- Versiegeln Sie alle vier Kanten des Deckglases mit klarem Nagellack. Lassen Sie die Objektträger 30 Minuten bei Raumtemperatur trocknen und lagern Sie sie dann flach bei 4 °C. Warten Sie mindestens 2 Stunden, bevor Sie ein Bild machen, oder fotografieren Sie es am nächsten Tag.
HINWEIS: Schnitte, die mit Antikörpern gegen GFP (grün fluoreszierendes Protein) und RFP (rot fluoreszierendes Protein) gefärbt sind, können bis zu 2 Wochen vor der Bildgebung gelagert werden, sofern sie vollständig mit Nagellack versiegelt sind.
