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Alle Verfahren zur Probenentnahme wurden in Übereinstimmung mit den IRB-Richtlinien des Instituts durchgeführt.
1. Gewebe schneiden
- Schneiden Sie ein kleines Stück des Gewebes (~1 cm x 1 cm) zum Schneiden ab. Legen Sie das restliche Taschentuch wieder in den Trockeneis-/-80 °C-Gefrierschrank.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der Gewebeabschnitt ~95% Kleinhirnrinde ist, wo sich die Purkinje-Zellen befinden.
- Platzieren Sie einen ca. 3 mm hohen Haufen OCT, um das "Futter" abzudecken. Beginnen Sie damit, die Schichten in langsamen, kreisenden Bewegungen darauf zu bauen, bis ein kleiner Hügel entsteht.
- Sobald das OCT teilweise eingefroren ist, aber noch etwas Flüssigkeit in der Mitte hat, legen Sie das Taschentuch darauf. Schieben Sie das Taschentuch nicht tief in das OCT. Lassen Sie das Taschentuch darauf sitzen, bis es vollständig gefroren ist, was 1-2 Minuten dauert.
- Setzen Sie das "Futter" mit dem gefrorenen OCT und das Gewebe in den Kryostat-Schneidarm ein. Stellen Sie das Taschentuch so ein, dass es bündig mit der Schneidklinge abschließt.
- Lassen Sie das Gewebe 15–20 Minuten lang im Schneidarm ruhen, um sich an die neue Temperatur anzupassen.
HINWEIS: Abhängig von der Dicke des Gewebes wird Zeit für die Temperaturakklimatisierung benötigt. Lassen Sie das Taschentuch so lange einwirken, wie es für einen sauberen Schnitt erforderlich ist. Passen Sie OT und CT an, um die Akklimatisierung der Gewebetemperatur zu unterstützen.
- Bewegen Sie das Taschentuch langsam näher an die Klinge. Sobald das Gewebe die Klinge erreicht hat, starten Sie den Trimmvorgang. Die Trimmdicke sollte auf 30 μm eingestellt werden.
- Trimmen Sie 2–3x, bis die Kortexschichten sichtbar sind.
- Platzieren Sie die Abrollschutzplatte direkt über der Kryostatklinge und richten Sie sie aus.
HINWEIS: Eine silberne Linie erscheint durch das Licht im Kryostaten an der Schnittstelle zwischen der Klinge und der Anti-Roll-Platte. Dies bedeutet, dass sich die Abrollschutzplatte direkt über der Kante des Messers befindet.
- Beginnen Sie mit dem Schneiden der Abschnitte bei 14 μm. Richtig geschnittene Abschnitte liegen flach unter der Anti-Roll-Platte.
HINWEIS: Wenn das Taschentuch feststeckt, stellen Sie sicher, dass die Abrollschutzplatte kalt genug ist. Wenn nötig, legen Sie ein Stück Trockeneis auf die Außenseite (Seite, die den Tisch nicht berührt), um die Anti-Roll-Platte schnell zu kühlen.
- Schneiden Sie 4-6 Abschnitte und richten Sie sie horizontal über den Kryostatentisch aus.
- Winkeln Sie den Objektträger an und heben Sie alle Teile des Gewebes auf einmal auf.
HINWEIS: Heben Sie mit den Bürsten die Enden des Gewebes an, um sie beim Aufnehmen für den Objektträger leichter zugänglich zu machen. Nehmen Sie nicht einen Abschnitt nach dem anderen auf. Die Exposition gegenüber Luft bei Raumtemperatur verschlechtert die RNA-Integrität.
VORSICHT: Lassen Sie die Membran nicht den Tisch des Kryostaten berühren. Wenn die Membran den Tisch berührt, beginnt sie sich vom Objektträger zu lösen und führt zu Fehlern beim Versuch des LCM.
- Fahren Sie sofort mit Schritt 6 fort. Verzögern Sie die Fixierung nicht.
2. Fixieren von Gewebe/fleckenfreie Visualisierung
- Sofort zum Ethanol-Fixierungsprotokoll übergehen
- Legen Sie die Rutsche für 2 min mit 70 % Ethanol in den Objektträgerhalter – auf Eis.
- Legen Sie die Folie für 45 s in den Folienhalter mit 95 % Ethanol — auf Eis.
- Legen Sie den Objektträger für 2 min mit 100% Ethanol in den Objektträgerhalter — bei RT.
- Tauchen Sie den Objektträger 3 Mal in den Objektträgerhalter mit Xylol 1 — bei RT.
- Legen Sie den Objektträger für 5 min — bei RT mit Xylol 2 in den Objektträgerhalter.
- Mindestens 30 Minuten an einem sauberen Ort trocknen lassen. Längere Trockenzeiten von bis zu 60 Minuten sind optimal.
ACHTUNG: Verwenden Sie zum Trocknen in einem Abzug Stand-up-Slides. Xylol ist flüchtig. Wenn Sie Objektträger flach hinlegen, sammelt sich Xylol im Gewebeabschnitt an, wodurch das Gewebe zu dunkel wird.
3. Auftauen von gespeicherten Objektträgern für den Gebrauch
- Nehmen Sie das Röhrchen mit einem einzigen Objektträger 1 h vor dem bestimmungsgemäßen Gebrauch aus dem -80 °C-Gefrierschrank.
- Öffnen Sie die Tube nicht sofort. Lassen Sie das Rohr auf Raumtemperatur kommen. Kondensation tritt nur an der Außenseite des Rohrs auf.
- Sobald das Rohr Raumtemperatur erreicht hat und das gesamte Kondenswasser verschwunden ist (ca. 30–40 Minuten), entfernen Sie die Kappe und setzen Sie den Objektträger Raumluft aus.
- Lassen Sie die Rutsche 15–20 Minuten lang auf Raumtemperatur akklimatisieren. Lassen Sie es dann mit entfernter Kappe in der Tube.
HINWEIS: Die Folie ist jetzt bereit für LCM.
4. Laser-Capture-Mikrodissektion von Purkinje-Zellen:
HINWEIS: Dieser Protokollabschnitt wird nur Einzelheiten im Zusammenhang mit der Entnahme von Purkinje-Zellen für die nachfolgende RNA-Sequenzierung diskutieren. In diesem Abschnitt wird davon ausgegangen, dass der Benutzer mit dem UV-Laser-Capture-Mikroskop und der zugehörigen Software vertraut ist.
- Reinigen Sie den Mikroskoptisch und den Kappenauffangarm mit dem RNase-Dekontaminator.
- Legen Sie den Objektträger mit behandschuhten Händen auf das Mikroskop und die 500 μl undurchsichtige Kappe in den Entnahmearm.
HINWEIS: Stellen Sie immer sicher, dass die RNA korrekt ist, indem Sie den Arbeitsbereich mit einem RNase-Dekontaminator reinigen und mit behandschuhten Händen den Objektträger oder die undurchsichtige Kappe berühren. Die Handschuhe können ausgezogen werden, sobald der Schieber und die Kappe angebracht sind und die Lasererfassung begonnen hat.
- Richten Sie die undurchsichtige Kappe bei geringer Vergrößerung über dem Kleinhirngewebe aus und stellen Sie sicher, dass die Kappe den gesamten im Okular sichtbaren Bereich abdeckt.
HINWEIS: Nur das Okular des Mikroskops zeigt, ob die undurchsichtige Kappe zentriert ist. Die Kamera zeigt nicht an, ob die Kappe über dem Gewebe zentriert ist. Abhängig von der Konstruktion des Laser-Erfassungszielfernrohrs erfolgt die Visualisierung durch die undurchsichtige Kappe entweder nur im Okular oder wird sowohl im Okular als auch in der Kamera visualisiert.
- Visualisieren Sie die Kleinhirnschichten mit einer 5x - 10x Objektivlinse und platzieren Sie den Cursor über dem Schnittpunkt, an dem sich Molekülschicht und Körnerzellschicht schneiden (die Purkinje-Zellschicht).
- Bewegen Sie sich auf 40X und visualisieren Sie Purkinje-Zellen.
HINWEIS: Siehe Abbildung 1 und Abbildung 2 für Beispielvisualisierungen.
- Beginnen Sie mit der Erfassung von Purkinje-Zellen.
HINWEIS: Mindestens 5 ng RNA sind erforderlich, um die RNA-Sequenzierung durchzuführen. Etwa 1600–2000 Purkinje-Zellen liefern genügend RNA-Material für die Sequenzierung. Die RNA ist am Mikroskop bis zu 8 Stunden lang stabil. Testen Sie die UV-Energie und den UV-Fokus vor der Sammlung, um sicherzustellen, dass die Werte korrekt sind. Im Laufe der Zeit trocknet das Gewebe weiter aus, und es kann sein, dass die UV-Energie und der UV-Fokus geändert werden müssen.
