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Alle Verfahren mit Tierproben wurden von der zuständigen Kommission für ethische Überprüfung der Tiere überprüft und genehmigt.
1. Lagerung von Gehirnen
- Entfernen Sie schnell die Gehirne von euthanasierten adulten CD1-Wildtyp-Mäusen mit einem Gewicht von etwa 30 g unter Verwendung eines herkömmlichen Ansatzes und frieren Sie sie 60 Sekunden lang entweder in flüssigem Stickstoff oder Isopentan ein, das mit Trockeneis vorgekühlt ist.
- Lagern Sie gefrorene Gehirne bis zur Verwendung bei -80 °C in Alufolie oder konischen Röhrchen.
2. Vorbereitung der Gehirnmatrix
- Legen Sie vierundzwanzig Stunden vor dem Präparieren von Gewebe eine saubere Gehirnmatrix auf einen Stapel aufgetauter Gefrierakkus. Stecken Sie die Seiten der Matrize zwischen zwei Gefrierakkus und achten Sie darauf, dass zwischen der Unterseite der Rasiererschlitze und der Oberseite der Gelpacks ein Abstand von etwa 0,5 cm bleibt (Abbildung 1A). Lege Alufolie auf die Enden, um das Abkühlen zu erleichtern.
ANMERKUNG: Wenn du eine Gehirnmatrix kaufst, kaufe eine, die groß genug ist, um das gesamte Volumen des zu präparierenden Gehirns zu umschließen.
- Stellen Sie die Box mit der Gehirnmatrix und den Gefrierakkus über Nacht mit offenem Oberteil in einen -20 °C-Gefrierschrank.
3. Einrichten einer gefrorenen Glasplatte
ANMERKUNG: Der Zweck dieses Aufbaus besteht darin, eine gefrorene Oberfläche vorzubereiten, auf der Gehirnschnitte seziert werden können.
- Legen Sie das Eis bis zu ca. 5 cm von der Oberseite entfernt in eine isolierte Box. Legen Sie dann eine 2,5 cm dicke Schicht Trockeneis auf das Eis und decken Sie es mit einer schwarzen Plastikfolie ab, um die Visualisierung der Probe zu erleichtern (Abbildung 1B, Abbildung 1C).
- Lege eine Glasplatte (sollte gerade in die Öffnung der Box passen) auf den Kunststoff und lege Trockeneis auf die Platte in den hinteren Ecken (Abbildung 1C).
- Nehmen Sie die gefrorene Gehirnmatrix aus dem Gefrierschrank und setzen Sie das zu schneidende Gehirn mit der Cortex-Seite nach oben ein. Lassen Sie es 10 Minuten lang an die Temperatur in der Box anpassen. Halten Sie den Deckel während dieser Zeit auf der Box.
- Passen Sie die Position des Gehirns in der Matrix mit einer kalten Pinzette so an, dass der Sinus sagittalis und der Sinus transversum mit den senkrechten Rillen des Blocks übereinstimmen (Abbildung 1D). Dies trägt dazu bei, symmetrische Schnitte für eine leichtere Zerlegung zu gewährleisten. Berühren Sie die Spitzen der Pinzette kurz mit dem Trockeneis, um zu kühlen, bevor Sie das Gehirn einstellen.
- Sobald das Gehirn in Position ist, platzieren Sie eine gekühlte Rasierklinge in der Nähe seiner Mitte und drücken Sie die Klinge etwa 1 mm in das Gewebe. Fügen Sie gekühlte Klingen an den rostralen und kaudalen Enden hinzu, um das Gehirn an Ort und Stelle zu halten (Abbildung 2A und Abbildung 2B).
- Beginnen Sie am rostralen Ende, fügen Sie die Klingen nacheinander hinzu, platzieren Sie sie in den Schlitzen und drücken Sie sie vorsichtig etwa 1 mm in das Gewebe (Abbildung 2B). Fügen Sie die Klingen in Abständen von 1 mm hinzu und arbeiten Sie sich zum kaudalen Ende hin.
- Achte darauf, dass sich das Gehirn in dieser Zeit nicht verschiebt. Richten Sie die Klingen horizontal und vertikal aus (Abbildung 2B). Mikrotomklingen mit niedrigem Profil können zum Schneiden von Abschnitten in Breiten von 0,5 mm verwendet werden. Lege diese zwischen die größeren Rasierklingen (Abbildung 2C).
- Sobald die Klingen an Ort und Stelle sind, drücken Sie mit den Fingern, der Handfläche oder einer anderen flachen Oberfläche auf die Gruppe (Abbildung 2C, Abbildung 2D). Bewegen Sie die Klingengruppe langsam von einer Seite zur anderen, um sie durch das Gewebe zu bewegen.
HINWEIS: Dies kann einige Zeit dauern (1–2 Minuten) und erfordert Geduld. Es sollte ein Widerstand gegen die Klingen vorhanden sein, die sich durch das Gewebe bewegen. Einfacher Einstieg bedeutet, dass das Gehirn auftaut und der Block mit Trockeneis gekühlt werden sollte.
- Wenn alle Klingen den Boden der Schlitze erreicht haben, fassen Sie jede Seite der Klingengruppe und wippen Sie hin und her, um sich von der Matrize zu befreien.
HINWEIS: Seien Sie vorsichtig, um sich nicht an den scharfen Kanten der Klingen zu schneiden.
- Sobald die Gruppe frei ist, legen Sie den Stapel mit der rostralen Seite nach oben auf die Glasplatte (Abbildung 2E). Legen Sie Trockeneis neben und/oder auf den Stapel, um die Proben weiter einzufrieren und die Trennung zu erleichtern.
- Platzieren Sie den Stapel mit den scharfen Kanten nach unten auf der Glasplatte und trennen Sie die Klingen, indem Sie den Stapel zwischen Daumen und Finger verschieben. Die Klingen sollten sich voneinander trennen und die Abschnitte sind angebracht.
- Richten Sie die Schnitte auf der Glasplatte von rostral nach kaudal aus (Abbildung 2F).
- Trennen Sie das Gewebe von den Klingen, indem Sie die Klingen zwischen den Fingern biegen oder mit einem zweiten kalten Rasiermesser trennen (Abbildungen 2G, 2H, 2I).
4. Abschnitte sezieren
- Öffnen Sie den Allen Mouse Brain Atlas oder eine andere Referenz und suchen Sie nach Orientierungspunkten, die zur Identifizierung von interessanten Regionen erforderlich sind. Zu den offensichtlichen Orientierungspunkten gehören die vordere Kommissur, das Corpus callosum, die lateralen Ventrikel und der Hippocampus (Abbildung 3).
- Drehen Sie den zu schneidenden Abschnitt mit einer gekühlten Pinzette um und stellen Sie sicher, dass der zu sammelnde Bereich überall konsistent ist. Konsultieren Sie während der Ernte häufig den Referenzatlas, um sicherzustellen, dass der richtige ROI erzielt wird.
HINWEIS: Eine Lupe oder ein Präpariermikroskop ist dabei oft hilfreich. Eine gute Beleuchtung ist ebenfalls unerlässlich. Zu diesem Zweck können LED-Lampen mit geringer Wattzahl oder eine kühle Lampe verwendet werden.
- Schneiden Sie mit einem sauberen Skalpell oder Stanzer in den Schnitt (Abbildung 4). Kühlen Sie jedes Werkzeug vor dem Schneiden vor, indem Sie es kurz berühren, um Eis zu trocknen. Schieben Sie die Klinge sanft, aber fest in das Gewebe und bewegen Sie sie hin und her, um den Schnitt zu machen. Drücke nicht zu stark, sonst bricht das Gewebe.
HINWEIS: Werkzeuge erwärmen sich mit der Zeit. Leicht erwärmte Klingen können helfen, saubere Schnitte zu machen und Brüche zu begrenzen, aber achten Sie darauf, dass das Gewebe nicht aufgetaut wird. Kühlen Sie die Werkzeuge regelmäßig auf Trockeneis.
- Sobald ein ROI geerntet ist, geben Sie ihn in etikettierte, vorgekühlte 1,5-ml-Röhrchen. Gelagertes Gewebe bis zur Verwendung bei -80 °C.
