Alle Verfahren mit Tierproben wurden von der zuständigen Kommission für ethische Überprüfung der Tiere überprüft und genehmigt.
1. Kultur und Belastung der Bandscheibe (IVD)
- Übertragen Sie die Bandscheiben (IVDs) in IVD-Kammern und fügen Sie IVD-Kulturmedium hinzu (Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, 4,5 g/L DMEM mit hohem Glukosegehalt für die physiologische Gruppe und 2 g/L DMEM mit niedrigem Glukosegehalt für die pathologische Gruppe) + 1 % Penicillin/Streptomycin + 2 % fötales Kälberserum + 1 % ITS (enthält 5 μg/ml Insulin, 6 μg/ml Transferrin und 5 ng/ml Selensäure) + 50 μg/ml Ascorbat-2-phosphat + 1 % nicht-essentielle Aminosäure + 50 μg/ml antimikrobieller Wirkstoff für Primärzellen) und in einen Inkubator bei 37 °C, 85 % Luftfeuchtigkeit und 5 % CO2 legen.
- Kultivieren Sie die Scheiben 4 Tage lang in einem Bioreaktorsystem gemäß Versuchsgruppen. In der pathologischen Gruppe sind degenerative Belastungsbedingungen bei 0,32-0,5 MPa, 5 Hz für 2 h/Tag zu halten. In der physiologischen Kontrollgruppe ist ein Belastungsprotokoll von 0,02-0,2 MPa, 0,2 Hz für 2 h/Tag zu verwenden.
HINWEIS: Positionieren Sie die IVDs während des Ladevorgangs in Kammern mit 5 mL IVD-Medium. Das Volumen hängt von der Größe der Beladekammern des Bioreaktors ab. Legen Sie die IVDs zwischen den Ladevorgängen in Sechs-Well-Platten mit 7 ml IVD-Kulturmedium, um die freie Quellung wiederherzustellen.
- Um die Veränderungen der Bandscheibenhöhe während des Versuchszeitraums zu analysieren, messen Sie die Bandscheibenhöhe mit einem Messschieber nach der IVD-Dissektion (Baseline) und dann täglich nach der freien Quellphase und nach dynamischer Belastung für die Versuchsdauer.
2. Intradiskale Tumornekrosefaktor-alpha (TNF-α)-Injektion
- Direkt nach dem ersten dynamischen Ladezyklus an Tag 1 legen Sie die IVDs in einer Petrischale in vertikaler Position und stabilisieren Sie die IVDs mit einer Pinzette.
- Rekombinante TNF-α (100 ng in 70 μl phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) pro IVD) mit einer 30-Gauge-Insulinnadel in das Nucleus pulposus-Gewebe der pathologischen Gruppe injizieren. Injizieren Sie langsam mit einer Geschwindigkeit von ca. 70 μl in 1 min.
- Ziehen Sie nach der Injektion die Spritze halb zurück in das IVD und ziehen Sie am Spritzenkolben, um ein Vakuum zu erzeugen, das verhindert, dass die injizierte Lösung zurückläuft, bevor Sie die Nadel und die Spritze vollständig aus dem IVD entfernen.
HINWEIS: Führen Sie ein Pilotexperiment durch, indem Sie PBS mit Trypanblau-Farbstoff injizieren, um die Verteilung der injizierten Lösung nach dem Laden und der Übernachtkultur zu bewerten.
