Induktion eines Schädel-Hirn-Traumas in einem Rattenmodell mit Hilfe eines lateralen Flüssigkeitsperkussionsgeräts

Zusammenfassung

Quelle: McGuire, M. J., et al. Verwendung eines drahtlosen Video-EEG-Systems zur Überwachung epileptiformer Entladungen nach einer durch laterale Flüssigkeitsperkussion induzierten traumatischen Hirnverletzung. J. Vis. Exp. (2019)

Dieses Video zeigt die Induktion eines Schädel-Hirn-Traumas (TBI) bei einer Ratte mit einem Gerät zur lateralen Flüssigkeitsperkussionsverletzung (FPI). Bei dem Verfahren wird ein Loch in den Schädel einer anästhesierten Ratte gebohrt, um die Dura mater freizulegen, an der eine Kanüle befestigt wird. Die Ratte wird dann mit dem Gerät verbunden, das eine Druckwelle erzeugt, die das Gehirn erreicht und ein Schädel-Hirn-Trauma nachahmt, indem es den Tod von Nervenzellen und Gefäßschäden verursacht

Protokoll

1. Verletzung durch flüssige Perkussion

1. Tragen Sie einen Laborkittel oder OP-Kittel, eine OP-Maske, OP-Handschuhe und eine Kopfbedeckung und sterilisieren Sie alle Werkzeuge und Materialien, die mit der Operationsstelle in Kontakt kommen.
2. Betäuben Sie eine 10-12 Wochen alte, männliche Wistar-Ratte (350-400 g) mit 3% Isofluran und 1 l/min Sauerstoff in einer für Ratten geeigneten Induktionskammer. Nehmen Sie die Ratte aus der Induktionskammer und bringen Sie sie in den Vorbereitungsbereich, sobald sie bewusstlos ist. Geben Sie die sterile Augensalbe in beide Augen.
3. Rasieren Sie die Haare auf dem Rattenkopf mit einer elektrischen Schermaschine mit einer #40-Klinge von knapp über den Augen bis zum kaudalen Ansatz der Ohren, um genügend Operationsfeld zu erzeugen. Entfernen Sie alle losen, abgeschnittenen Haare von der Stelle.
4. Reinigen Sie die Operationsstelle, indem Sie ein 2%iges Chlorhexidin-Peeling auf die rasierte Kopfhaut auftragen, gefolgt von 70% Ethanol. Beginnen Sie in der Mitte und bewegen Sie sich in konzentrischen Kreisen nach außen, weg von der Inzisionsstelle. Wiederholen Sie diesen Vorgang 3 Mal. Tragen Sie die Betadin-Lösung auf die gleiche Weise auf die Stelle auf und lassen Sie sie trocknen.
5. Setzen Sie die anästhesierte Ratte in den stereotaktischen Rahmen ein und halten Sie die Anästhesie bei 2-3% Isofluran-1 L/min Sauerstoff über den Nasenkonus aufrecht. Überprüfen Sie, ob der Entzugsreflex der Hintergliedmaßen und der Lidreflex verloren gegangen sind, um sicherzustellen, dass sich die Ratte in einer chirurgischen Anästhesieebene befindet.
6. Überwachen Sie die Atemfrequenz, die Herzfrequenz, die Körpertemperatur und die Sauerstoffsättigung während der gesamten Operation. Halten Sie die Herzfrequenz zwischen 300 und 400 Schlägen pro Minute und den SpO₂ über 90 %.
   HINWEIS: Ein Pulsoximeter, das an einem hinteren Fuß befestigt ist, kann verwendet werden, um die Herzfrequenz und den SpO₂ konstant abzulesen. Eine Herzfrequenz über 400 Schlägen pro Minute deutet darauf hin, dass die Ratte nicht ausreichend betäubt ist. Ein selbstregulierendes Wärmekissen, das mit einem auf 37 °C eingestellten Rektalthermometer gekoppelt ist, kann während der gesamten Operation unter der Ratte positioniert werden, um die Körpertemperatur zu halten. Ein Stereomikroskop mit einer Lichtquelle in Kombination mit einer Lichtwellenleiterlampe sind hilfreich, um den Eingriff zu visualisieren.
7. Verwenden Sie eine 23-g-Nadel, um 0,5 % Bupivacainhydrochlorid intradermal in die Kopfhaut an der Inzisionsstelle zu injizieren, um 10 - 15 Minuten vor dem Einschnitt eine lokale Analgesie durchzuführen.
8. Machen Sie mit einer #10 Skalpellklinge einen 1,5-2,5 cm langen Schnitt in der Mittellinie durch die Haut und den Muskel der Kopfhaut. Ziehen Sie die Haut und den Muskel zurück, um den Schädel freizulegen und ein klares Operationsfeld zu schaffen. Reflektieren Sie die darunter liegenden Faszien und das Fettgewebe mit sterilen Wattestäbchen vom Knochen weg.
   HINWEIS: Ein elektrisches Kautergerät ist nützlich, um eine schnelle Blutstillung zu erreichen.
9. Rasieren Sie den lateralen Kamm des linken Scheitelknochens mit einer chirurgischen Kürette ab, um eine glatte, ebene Oberfläche zu erhalten, so dass die Basis der weiblich-weiblichen Luer-Lock-Nabe bündig mit dem Schädel abschließt.
10. Spülen Sie die Schädeloberfläche und das umgebende Gewebe mit 2,0 mg/ml Gentamicinlösung in steriler Kochsalzlösung. Überschüssige Lösung mit einem sterilen Tupfer abtupfen.
11. Tragen Sie 3% Wasserstoffperoxid auf den Schädel auf, um den Knochen zu trocknen.
    HINWEIS: Wenn der Knochen nicht ausreichend trocken ist, haftet der Zahnzement nicht richtig und bildet eine feste Abdichtung.
12. Erstellen Sie eine Kraniektomiestelle mit einem Durchmesser von 5 mm durch den linken Parietalknochen.
    HINWEIS: Ein Trepanbohrer, der in eine Bohrmaschine gesteckt wird, die am stereotaktischen Rahmen befestigt ist, kann hilfreich sein, um die Kraniektomie einzuleiten. Verwenden Sie einen Handbohrer mit einem Trepan von 5 mm Durchmesser, um die Kraniektomie langsam durch den verbleibenden Knochen zu beenden. Wenn die Kraniektomie kurz vor Abschluss steht, drehen Sie den Trepan in umgekehrter Richtung, um einen Bruch der darunter liegenden Dura mater zu verhindern. Der Schädel wird um den Umfang der Bandscheibe herum dünner und der Schädellappen fühlt sich locker an, wenn er leicht gedrückt wird.
13. Entfernen Sie den Knochenlappen mit der chirurgischen Kürette und glätten Sie die Gewebezange.
    HINWEIS: Es kann zu Blutungen kommen, aber die Blutstillung kann schnell erreicht werden, indem man sanften Druck mit sterilen Wattestäbchen ausübt.
14. Verwenden Sie ein Stereomikroskop und eine Beleuchtung, um die Dura visuell auf Anzeichen einer Ruptur zu untersuchen. Ein dünner Knochenrand verbleibt um den Umfang der Kraniektomiestelle. Entfernen Sie diesen Rand vorsichtig mit einer glatten Gewebezange und achten Sie darauf, dass die Dura nicht reißt.
15. Tupfen Sie den Schädel mit 70% Ethanol ab, um jeglichen Knochenstaub zu entfernen und den Schädel zu trocknen.
16. Tragen Sie eine dünne Schicht Cyanacrylat-Gelkleber um die Unterkante der Luer-Lock-Nabe auf und befestigen Sie ihn über der Kraniektomie am Schädel, ohne die Öffnung zu behindern. Seien Sie vorsichtig, um keinen Klebstoff mit der Dura in Berührung zu bringen. Versiegeln Sie außerdem den Luer-Lock mit einer zusätzlichen dünnen Schicht Kleber um die äußere Basis der Nabe.
17. Bereiten Sie eine Aufschlämmung aus Zahnzement vor. Tragen Sie den Zement auf die Oberfläche des Schädels um und über die Basis der Luer-Lock-Nabe auf, um sie an Ort und Stelle zu halten.
18. Füllen Sie die Luer-Lock-Nabe mit einer sterilen, konservierungsmittelfreien künstlichen Liquorlösung (pH 7,4) mit einer Spritze und einer Nadel, so dass ein konvexer Bolus aus Kochsalzlösung über der Oberseite des Randes zu sehen ist.
    HINWEIS: Die Lösung hält die Dura feucht, während der Zahnzement trocknet, und dient als Hinweis auf die Unversehrtheit der Versiegelung. Wenn der Lösungsstand überhaupt absinkt, ist das ein Hinweis auf ein Leck im System und der Luer-Lock muss entfernt und ausgetauscht werden.
19. Sobald der Zahnzement vollständig ausgehärtet ist, brechen Sie die Gasanästhesie ab und entfernen Sie die Ratte aus dem stereotaktischen Rahmen.
20. Platzieren Sie die Ratte auf einer Plattform neben dem FPI-Gerät.
21. Das FPI-Gerät hat eine gebogene Metallspitze, die vom Druckmessumformer am Ende des Flüssigkeitsbehälters ausgeht. Befestigen Sie einen 12 cm langen Druckschlauch am Ende der gebogenen Spitze, wobei das gegenüberliegende Ende in einem 2 cm langen Luer-Lock-Drehstecker endet. Befestigen Sie die Ratte am FPI-Gerät, indem Sie das weibliche Ende der Nabe am Schädel der Ratte mit dem männlichen Stecker verbinden.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Verbindung fest verschlossen ist und dass alle Luftblasen aus dem System entfernt wurden.
22. Legen Sie das Tier in die Brustbeinlage und prüfen Sie wiederholt, ob der Rückzugsreflex zurückkehrt. Sobald die Ratte den Entzugsreflex wiedererlangt, aber immer noch sediert ist, lässt sie das Pendel des FPI-Geräts los, um einen einzelnen Druckimpuls von 20 ms zu erzeugen und eine Verletzung herbeizuführen.
    HINWEIS: Es ist wichtig, die Verletzung nicht herbeizuführen, während das Tier tief betäubt ist, da dies aufgrund eines neurogeninduzierten Lungenödems tendenziell zu einer erhöhten Sterblichkeit führt. Alle Geräte weisen Variabilität auf. Bei dem für dieses Experiment verwendeten Gerät erzeugt jedoch eine 17°-Winkelstellung des Hammers einen atmosphärischen Druckimpuls von 2,2 - 2,3. Unverletzt durchlaufen Scheintiere alle die gleichen Prozeduren, mit Ausnahme des eigentlichen Flüssigkeitsimpulses, um die Verletzung herbeizuführen.
23. Trennen Sie die Ratte nach einer Verletzung sofort vom FPI-Gerät, legen Sie sie in die Brustbeinlage und geben Sie zusätzlichen Sauerstoff (1 l/min) über einen Nasenkonus, bis die spontane Atmung zurückkehrt. Apnoe ist eine zu erwartende Folge der Verletzung. Falls erforderlich, führen Sie regelmäßige manuelle Beatmungen über eine Beutelventilmaske durch, bis die Ratte beginnt, von selbst zu atmen.
    HINWEIS: Typischerweise dauert Apnoe weniger als 2 Minuten. Unmittelbar nach der Verabreichung des Druckimpulses wird ein vorübergehender schneller Anstieg der Herzfrequenz (>500 Schläge pro Minute) aufgrund eines Katecholamin-Bursts beobachtet. Dies kann mit einem Pulsoximeter, das am Fuß der Ratte befestigt ist, überwacht werden und kann als möglicher Indikator dafür dienen, dass eine schwere Verletzung aufgetreten ist.
24. Überwachen Sie die Ratte kontinuierlich und notieren Sie den Zeitpunkt der Rückkehr des Aufrichtreflexes (stabiler Gang an allen vier Gliedmaßen).
25. Die Stärke des atmosphärischen Druckimpulses sollte für jede Ratte innerhalb von ± 0,05 Atmosphären liegen. Vergewissern Sie sich, dass jeder der Druckimpulse ein gleichmäßiges Signal auf dem Oszilloskop mit gleichbleibender Amplitude und Dauer erzeugt.
    HINWEIS: Ein verrauschtes Signal kann auf Luftblasen im System hinweisen, die entfernt werden müssen, bevor der Verletzungsimpuls abgegeben wird. Atmosphärische Druckimpulse, die in diesem Experiment eine schwere Verletzung verursachen, sind solche, die typischerweise zu Tieraufrichtungszeiten von 30-60 Minuten führen. Dieser Bereich der Aufrichtungszeiten ist mit einer Mortalitätsrate von ca. 40-50% verbunden.
26. Verabreichen Sie 10 ml vorgewärmte Kochsalzlösung subkutan als unterstützende Pflege.
27. Bringen Sie die Ratte in ihren Käfig zurück und lassen Sie sie mindestens 4 Stunden lang ruhen.
    HINWEIS: Eine erhöhte Sterblichkeit wurde beobachtet, wenn die Ratten sofort wieder unter Narkose gesetzt wurden.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
1,00 mm Bohrer	Drill Bit City: Neue Hartmetallwerkzeuge	05M200
3M ESPE Durelon Carboxylat Zement	3M , Neuss, Deutschland	38019	Zahnzement
4-0 Naht	Ethicon, Sommerville, NJ	K831H	4-0 Ethicon Perma-Hand Silk, 26mm 1/2c Taperpoint, 30" (75cm), Schwarz Geflochtenes, nicht resorbierbares Naht
5 mm Außendurchmesser Trepan	Werkzeuge der Feinforschung	18004-50
Dumont #6 Pinzette	Feine wissenschaftliche Werkzeuge	11260-20
Dumont #7b Pinzette	Werkzeuge der Feinforschung	11270-20
ecgAUTO	EMKA Technologies, Falls Church, VA
Kupplung mit weiblichem Luergewinde aus klarem Polycarbonat	Cole-Palmer-Instrument	SKO#45501-22	Los #214271
Fuß-Bohrmaschine	Grobet USA, Carlstadt, NJ	Modell C-300
GentaMax 100 (Gentamicin, Sulfatlösung)	Phoenix, hergestellt von Clipper Distributing Company LLC, St. Joseph, MO		NDC 57319-520-05
Hill's Prescription Diet a/d Canine/ Feline	Hill's Pet Nutrition, Inc. , Topeka, KS
IOX2-Software	EMKA Technologies, Falls Church, VA
Isoflorane, Alleinstellungsmerkmal	Piramal Enterprise Limited, Andhra, Indien		NDC 66794-013-25
IsoTech Anästhesiegerät	SurgiVet	WWV9000
Seitliches FPI-Gerät	AmScien	302	gebogene Spitze, mit Verlängerung des Druckschlauchs. Anschluss über Schraubverbinder (Cole-Palmer; #4550-22)
Leica A60 Stereomikroskop	Leica Biosystems, Richmond, Virginia	PN: 10 450 488
Marcain (0,5%) Bupivacain hcl Injektion usp 5 mg/ml	Hospira, Lake Forest, Illinois	CA-3627	50 ml Durchstechflasche mit mehreren Dosen; NDC 0409-1610-50
Micro-Adson-Pinzette	Feine wissenschaftliche Werkzeuge	11018-12
Olsen-Hegar Nadelhalter mit Nahtschneidern	Feine wissenschaftliche Werkzeuge	12002-14
PALACOS R+G Knochenzement mit Gentamicin	Heraeus,	REFERENZ: 5036964	Röntgendichter Knochenzement mit 1 x 0,5 g Gentamicin
Povidon-Jod-Lösung			Betadin
Puralube Vet Salbe	Dechra Veterinärprodukte, Overland Park KS		NDC 17033-211-38
Skalpellklinge (#10) und Halter	Integra Miltex, York, PA	NR.: 4-110
Skalpellgriff - #4	Feine wissenschaftliche Werkzeuge	10004-13
Sichelmesser	Bausch + Lomb Storz Instrumente	N1705 HM	5 mm gebogene Klinge. Runder Griff. Gesamtlänge 168 mm, 6,6 Zoll.
Silverstein Mikrospiegel	Bausch + Lomb Storz Instrumente	N1706 S8	3mm Durchmesser. 45 Grad abgewinkelt. Gesamtlänge 180 mm, 7,2 Zoll
Thermische Kautereinheit	Geiger Medizintechnik, Delasco Council Bluffs, IA	Modellnummer: 150
Vetivex	Dechra Veterinärprodukte, Overland Park KS		pHyLyteTM Injektion für Veterinärmedizin pH 7.4 (Mehrfachelektrolyt-Injektion, Typ 1, USP)
Wistar IGS Ratten	Charles River	Stammcode 003	12 Wochen alt zum Zeitpunkt der Verletzung
Wullstein-Retraktor	Feine wissenschaftliche Werkzeuge	17018-11