Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom örtlichen institutionellen Tierpflegeausschuss und der Tierarztprüfung von JoVE überprüft.
1. Vorbereitung vor der Gewebeentnahme
- Stellen Sie die Zentrifuge auf 4 oC ein.
- Brennpolitur eines Sets von drei Pasteur-Glaspipetten mit abnehmenden Durchmessern von ca. 1,3, 0,8 und 0,4 mm für jede Probe.
- Bereiten Sie beschriftete 1,7-ml-Röhrchen mit 1 ml kaltem Puffer A vor und stellen Sie die Röhrchen auf Eis.
- Bereiten Sie eine Eisschale vor, in der sich die Gehirnschneidematrix, Spatel und Glasplatten (oder eine umgekehrte Petrischale aus Glas) befinden, auf der Sie die Dissektion durchführen können. Kühle zwei oder mehr Rasierklingen auf den Glasplatten vor und trockne alle Instrumente, die mit dem Taschentuch in Berührung kommen, mit Seidenpapier.
- Tauen Sie die Enzymlösung vor der Gewebeentnahme 30 Minuten lang bei Raumtemperatur (RT) auf.
2. Gewebeentnahme und -sektion
- Beginnen Sie die verhaltenstherapeutische oder pharmakologische Behandlung 90 Minuten vor der Gewebeentnahme.
ANMERKUNG: Für die hier gezeigten Ergebnisse wurden akute intraperitoneale Injektionen von 5 mg/kg Methamphetamin an Ratten in einer neuartigen Umgebung (Testbedingung) und an naiven Ratten, die in ihren Heimkäfigen gehalten wurden (Kontrollbedingung), durchgeführt.
- Betäuben Sie die Ratte, indem Sie sie in ein Exsikkatorglas mit gesättigtem Isofluran legen und enthaupten Sie die Ratte 30 - 60 Sekunden später mit einer Guillotine.
Entferne mit einer Schere die Haut und die Muskeln vom Kopf und lege den Schädel frei. Verwende Rongeure, um den Schädel zu schneiden, das Foramen magnum zu öffnen und den hinteren Teil des Schädels zu entfernen. Verwende Rongeure, um entlang der oberen Ränder des Schädels zu schneiden, um das Gehirn freizulegen. Achte darauf, das Gehirn nicht zu schädigen. Verwenden Sie einen kleinen Spatel, um das Gehirn vorsichtig zu unterdrücken und anzuheben. Hebe das Gehirn an und durchtrenne die Nerven, bis das Gehirn frei ist.
- Präpariere Gewebe mit Rasierklingen.
HINWEIS: Entnahme von Gewebeproben mit einer der folgenden Methoden: (2.3.1) frisch präpariertes Gewebe; (2.3.2) gefrorenes Gewebe nach der Dissektion; oder (2.3.3) gefrorenes Gewebe, das aus gefrorenem ganzem Gehirn präpariert wurde. Halten Sie die Schneidematrix des Gehirns, die Rasierklingen und die Glasplatte während des Dissektions- und Zerkleinerungsprozesses trocken, da Kondenswasser zu einer hypotonen Lyse der Zellen führen kann. Verwenden Sie eine Lupe, um eine genaue Sektion zu gewährleisten.
- Für frisch präpariertes Gewebe legen Sie das frisch extrahierte Gehirn in eine Gehirnschneidematrix (eine rattengehirnförmige Metallform mit Schlitzen für die Rasierklingen im Abstand von 1 mm), die auf Eis gekühlt wurde. Führen Sie zwei oder mehr vorgekühlte Rasierklingen in die Schlitze ein, um koronale Scheiben zu schneiden, die die interessierende(n) Gehirnregion(en) enthalten. Legen Sie die geschnittene Scheibe auf die gekühlte Glasplatte.
Hinweis: Sezieren Sie die interessierenden Hirnregionen auf einer gekühlten Glasplatte.
- Bei gefrorenem Gewebe nach der Dissektion ist die interessierende(n) Hirnregion(en) aus Scheiben frisch extrahierten Gehirns zu präparieren, ähnlich der oben in 2.3.1 beschriebenen. Legen Sie das präparierte Gewebe in ein Mikroröhrchen und frieren Sie das Gewebe schnell ein, indem Sie das Mikroröhrchen 20 Sekunden lang in -40 ºC Isopentan tauchen. Bewahren Sie präpariertes Gewebe bis zur Weiterverarbeitung immer in einem Gefrierschrank bei -80 ºC auf.
- Bei gefrorenem Gewebe das frisch extrahierte Gehirn sofort in -40 ºC Isopentan einfrieren und in einem versiegelten Beutel bei -80 ºC bis zu 6 Monate aufbewahren.
- Legen Sie das gefrorene Gehirn am Tag der Sektion für ca. 2 Stunden in einen Kryostaten, der auf ca. -20 ºC (nicht wärmer als -18 ºC) eingestellt ist, um die Temperatur auszugleichen.
HINWEIS: Gehirne können bei dieser Temperatur leicht geschnitten werden, während viel kühlere Temperaturen das Gehirn zu spröde machen, um sicher geschnitten zu werden.
- Schneiden Sie mit Rasierklingen 1 - 2 mm große koronale Scheiben des gefrorenen Gehirns in einem Kryostaten. Verwenden Sie unter Gefrierbedingungen eine abgestumpfte 12- bis 16-Gauge-Nadel, um Gewebestanzen aus diesen Scheiben zu erhalten. Bewahren Sie präpariertes Gewebe bis zur weiteren Verarbeitung immer eingefroren auf.
- Fügen Sie 1 - 2 Tropfen Puffer A hinzu, um das präparierte Gewebe vor dem Zerkleinern zu bedecken. Entfernen Sie den größten Teil der weißen Substanz mit zwei Rasierklingen aus dem Gewebe, um den Verlust von Neuronen während des restlichen Verreibungsprozesses zu verhindern. Wenn Sie mit gefrorenem Gewebe beginnen, lassen Sie das Gewebe nicht länger als 1 Minute auf der kalten Glasplatte auftauen, bevor Sie Puffer-A-Lösung auftragen.
- Zerkleinern Sie das Gewebe 100 Mal in orthogonaler Richtung mit einer Rasierklinge auf einer gekühlten Glasplatte. Halten Sie die Rasierklinge beim Zerkleinern senkrecht an die Glasplatte.
HINWEIS: Gründliches Zerkleinern ist für alle Protokollschritte von entscheidender Bedeutung.
- Übertragen Sie das zerkleinerte Gewebe mit Rasierklingen in Mikrozentrifugenröhrchen mit 1 ml kaltem Puffer A. Drehen Sie das Röhrchen 3 - 5 Mal um, um das gesamte zerkleinerte Gewebe in der Lösung zu halten.
3. Zelldissoziation
HINWEIS: Verwenden Sie für alle folgenden Schritte ein sanftes Mischen von Ende zu Ende. Verwenden Sie keinen Wirbelmischer und vermeiden Sie Luftblasen, die Zellschäden verursachen.
- Die Probenröhrchen bei 110 x g für 2 min bei 4 ºC zentrifugieren. Überstand verwerfen. Geben Sie langsam 1 ml kalte, frisch aufgetaute Enzymlösung (enthält eine Mischung aus proteolytischen Enzymen) in die Innenwand des Mikroröhrchens. Saugen Sie sofort das gesamte Pellet auf und ab und pipettieren Sie es nur 4 Mal vorsichtig mit einer Pipette mit mäßigem Spitzendurchmesser auf und ab, um das gehackte Gewebepellet zu dispergieren.
- Drehen Sie die Mikroröhrchen sofort um, um zu verhindern, dass das Pellet am Boden kleben bleibt, und inkubieren Sie die Proben 30 Minuten lang bei 4 oC.
- Nach der enzymatischen Gewebeverdauung zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 960 x g für 2 min bei 4 ºC. Entfernen Sie den Überstand und fügen Sie 0,6 ml kalten Puffer A hinzu. Unmittelbar nach der Zugabe von Puffer A verwenden Sie dieselbe Pipettenspitze, um das Pellet zu dispergieren, indem Sie das gesamte Pellet aufsaugen und vorsichtig 5 Mal auf und ab pipettieren.
- Zerreiben Sie das verdaute Gewebe mechanisch und sammeln Sie es in 15-ml-Röhrchen mit den folgenden Schritten. Verwenden Sie für jede Probe einen separaten Satz von 3 feuerpolierten Pasteur-Pipetten aus Glas mit absteigenden Durchmessern von ca. 1,3, 0,8 und 0,4 mm, die an Latexkolben befestigt sind.
- Zerreiben Sie jede Probe 10 Mal vorsichtig mit der 1,3-mm-Glaspipette. Lassen Sie die Probe 2 Minuten lang auf Eis ruhen (die Ablagerungen und undissoziierten Zellen setzen sich am Boden ab). Sammeln Sie den Überstand (~ 0,6 ml) und geben Sie ihn in ein konisches 15-ml-Röhrchen (Röhrchen #1).
- Geben Sie 0,6 ml Puffer A Lösung zum restlichen Pellet. Zerreiben Sie die Probe 10 Mal mit der 0,8 mm Glaspipette. Lassen Sie die Probe 2 Minuten auf Eis ruhen. Sammeln Sie den Überstand (~ 0,6 ml) und geben Sie ihn in das gleiche konische 15-ml-Röhrchen #1.
- Geben Sie 0,6 ml Puffer A Lösung zum restlichen Pellet. Zerreiben Sie die Probe 10 Mal mit der 0,4 mm Glaspipette. Lassen Sie die Probe 2 Minuten auf Eis ruhen. Sammeln Sie den Überstand (~ 0,6 ml; ohne das Pellet mit nicht dissoziierten Zellen zu berühren) und geben Sie es in das gleiche konische 15-ml-Röhrchen #1.
HINWEIS: Bewahren Sie die Pipette mit einem Durchmesser von 0,4 mm für die folgenden Verreibungsschritte in der Tube #1 auf.
- Schritt 3.4.3 noch dreimal mit der kleinsten Glaspipette (~ 0,4 mm Durchmesser) wiederholen und den Überstand in ein separates konisches 15-ml-Röhrchen (Röhrchen #2) auffüllen.
- Zerreiben Sie die gesammelten Zellsuspensionen in den Röhrchen #1 und #2 weitere 10 Male mit der 0,4 mm Glaspipette und halten Sie sie auf Eis.
4. Zellfixierung und Permeabilisierung
- Bereiten Sie 4 Mikroröhrchen pro Probe vor (zwei Mikroröhrchen für Zellen aus Röhrchen #1 und zwei für Zellen aus Röhrchen #2) vor, indem Sie 800 μl 100 % kaltes Ethanol (vor Gebrauch bei -20 oC gelagert) in jedes Röhrchen geben und auf Eis halten. Hinweis: Die endgültige Ethanolkonzentration beträgt 50 %.
- Pipettieren Sie ~ 800 μl der Zellsuspensionen (aus Röhrchen #1 und Röhrchen #2) in jedes der 4 Röhrchen mit kaltem Ethanol und drehen Sie die Röhrchen um, um die Proben zu mischen.
- Inkubieren Sie die Röhrchen 15 Minuten lang auf Eis, während Sie die Röhrchen alle 5 Minuten umdrehen.
- Nach der Fixierung/Permeabilisierung zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 1.700 x g für 4 min bei 4 ºC und verwerfen den Überstand. Lassen Sie 50 μl Lösung übrig, um Zellverlust zu vermeiden.
HINWEIS: Die Pellets sind in diesem Stadium weiß und kleben weniger an der Wand der Röhren als vor der Permeabilisierung. Entfernen Sie daher vorsichtig den Überstand, indem Sie die Wand des Mikroröhrchens berühren, an der sich kein Pellet befindet, und ziehen Sie den Überstand langsam mit einer Mikropipette auf.
5. Zellfiltration
- Die Pellets aus Schritt 4.4 mit kaltem PBS wie folgt wieder aufhängen:
- Geben Sie 550 μl kaltes PBS in eines der beiden Mikroröhrchen aus Röhrchen #1 und pipettieren Sie die Zellsuspension mit einer Pipettenspitze mit mäßigem Durchmesser vorsichtig 5 Mal auf und ab. Wiederholen Sie das Gleiche für ein Mikroröhrchen, das aus Rohr #2 kommt.
- Bei Zellen aus Röhrchen #1 wird mit derselben Pipette die erste Zellsuspension auf das zweite Pellet übertragen. Resuspendieren Sie das zweite Pellet, indem Sie die kombinierte Zellsuspension 5 Mal vorsichtig auf und ab pipettieren.
- Für Zellen aus Röhrchen #2 resuspendieren und kombinieren Sie die Pellets (d.h. dritte und vierte Mikroröhrchen), wie in 5.1.2 beschrieben.
