Gewinnung einer Einzelzellsuspension aus gefrorenem Hirngewebe von Ratten

Zusammenfassung

Quelle: Rubio, F. J., et. al. Fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) und Genexpressionsanalyse von Fos-exprimierenden Neuronen aus frischem und gefrorenem Rattenhirngewebe. J. Vis. Exp. (2016)

Dieses Video zeigt die Dissoziation von gefrorenem Rattenhirngewebe in eine einzellige Suspension durch enzymatische Verdauung und mechanische Verreibung. Die präparierten Zellen werden fixiert und mit Ethanol für nachgelagerte Anwendungen wie Durchflusszytometrie oder Genexpressionsanalyse permeabilisiert.

Protokoll

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom örtlichen institutionellen Tierpflegeausschuss und der Tierarztprüfung von JoVE überprüft.

1. Vorbereitung vor der Gewebeentnahme

1. Stellen Sie die Zentrifuge auf 4 ^oC ein.
2. Brennpolitur eines Sets von drei Pasteur-Glaspipetten mit abnehmenden Durchmessern von ca. 1,3, 0,8 und 0,4 mm für jede Probe.
3. Bereiten Sie beschriftete 1,7-ml-Röhrchen mit 1 ml kaltem Puffer A vor und stellen Sie die Röhrchen auf Eis.
4. Bereiten Sie eine Eisschale vor, in der sich die Gehirnschneidematrix, Spatel und Glasplatten (oder eine....

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Gehirn-Matrix	CellPoint Wissenschaftlich	69-2160-1	Um koronale Hirnschnitte zu erhalten
Ruhezustand Eine niedrige Fluoreszenz	Gehirn-Bits	HA-lf	Puffer A' im Protokoll wird für die Verarbeitung von Gewebe und Zellen von der Dissoziation bis zu den Fixierungsschritten verwendet
Accutase	Millipore	SCR005	Die im Protokoll enthaltene "Enzymlösung" wird für den enzymatischen Aufschluss des Gewebes vor der Verreibung verwendet
Zellsieb, 40 μm	BD Falke	352340	So filtern Sie die Zellsuspension
Zellsieb, 100 μm	BD Falke	352360	So filtern Sie die Zellsuspension
Falcon 5 ml Reagenzglas aus Polystyrol mit rundem Boden und Schnappverschluss für das Zellsieb	BD Biowissenschaften	352235	Zur Filterung der Zellsuspension vor dem Passieren des Durchflusszytometers
Pasteurpipette, Glas	NIH-Versorgung	6640-00-782-6008	Gewebeverreibung durchführen