Beurteilung des Palmitoylierungszustands von Zellmembranproteinen aus Hirngewebe der Maus

Zusammenfassung

Quelle: Speca, D. J., et al. Acyl-PEGylaustausch-Gel-Shift-Assay zur quantitativen Bestimmung der Palmitoylierung von Hirnmembranproteinen. J. Vis. Exp. (2020).

Das Video zeigt die Analyse des Palmitoylierungszustands von Zellmembranproteinen, die aus Hirngewebe von Mäusen isoliert wurden. Der Prozess beinhaltet das Freilegen der nicht-palmitoylierten Cysteine und deren Blockierung, dann unter Verwendung eines Polymers, das an die palmitoylierten Cysteine bindet, was bei der Beurteilung des Palmitoylierungszustands der isolierten Proteine hilft.

Protokoll

Alle Verfahren, bei denen Tierproben verwendet werden, wurden von der zuständigen Kommission für die ethische Überprüfung der Tiere überprüft und genehmigt.

1. Präparation der Membranen des Mausgehirns

1. Enthaupten Sie die Maus mit einem Guillotine-Gerät und zerlegen Sie das Gehirn schnell (in <1 min, wenn möglich, um Veränderungen der Palmitoylierung, die während des Dissektionsvorgangs auftreten können, zu minimieren). Sofort in 10 mL Homogenisierungspuffer (Tabelle 1) in einem Glashomogenisator (~12 Hübe) auf Eis homogenisieren.
2. Zentrifugieren Sie die Lysate 15 min lang bei 1.400 x g bei 4 °C. Den Überstand in ein neues Röhrchen auf Eis umfüllen. Das Pellet (~6 Hübe) in einem gleichen Volumen Homogenisierungspuffer resuspendieren und bei 710 x g für 10 min bei 4 °C zentrifugieren.
3. Die Überstände aus Schritt 1.2 werden kombiniert und bei 40.000 x g für 20 min bei 4 °C zentrifugiert.
4. Der Überstand (zytosolische Fraktion) wird verworfen und die pelletierte Membranfraktion (P2) wird in Homogenisierungspuffer resuspendiert.
   HINWEIS: Proben können schockgefroren und für die spätere Verwendung bei -80 °C gelagert werden.
5. Führen Sie einen Bicinchoninsäure (BCA)-Assay durch, um den Proteingehalt zu quantifizieren. Beginnen Sie für den Acyl-PEGyl-Austausch-Gel-Shift-Assay (APEGS) mit ~100-200 mg Protein (maximal 250 mg) in einem Volumen von 470 μl Puffer A (Tabelle 1) in einem 1,5-ml-Röhrchen. Beschallung und Zentrifugation bei >13.000 x g für 10 min bei 25 °C, um unlösliches Protein zu entfernen. Übertragen Sie das gelöste Protein in ein neues 1,5-ml-Röhrchen.

2. Acyl-PEGylaustausch-Gel-Shift-Assay (APEGS)-Assay

1. Brechen Sie Disulfidbindungen auf und blockieren Sie freie Cysteine.
   1. Disulfidbindungen durch Inkubation in 25 mM Tris(2-carboxyethyl)phosphin (TCEP; 25 μl, zugegeben aus einer Stammlösung); Tabelle 1) für 60 min bei 55 °C.
   2. Blockieren Sie freie Cysteine mit 50 mM N-Ethylmaleimid (NEM; 12,5 μL, zugegeben aus einer Stammlösung; Tabelle 1) bei Raumtemperatur für 3 h.
      HINWEIS: Die Reaktion kann über Nacht verlängert werden.
2. Führen Sie eine Fällung mit Chloroformmethanol (CM) durch.
   1. Übertragen Sie die Proteinlösung aus dem 1,5-ml-Röhrchen in ein Polypropylen- oder Glasröhrchen, das in einem schwingenden Schaufelrotor bei bescheidener Geschwindigkeit zentrifugiert werden kann. Ideal ist ein 5-ml-Röhrchen. Fügen Sie vier Volumen (2 mL) Methanol (MeOH) hinzu und wirbeln Sie kurz ein.
   2. Fügen Sie zwei Volumen (1 ml) Chloroform hinzu und wirbeln Sie kurz vortexen.
   3. Drei Volumen (1,5 mL) deionisiertes Wasser (dH₂O) zugeben und kurz vortexen.
   4. Zentrifugieren Sie die Proben bei 3.000 x g für 30 min bei 25 °C in einem schwingenden Schaufelrotor.
   5. Entfernen Sie vorsichtig die obere Phase und entsorgen Sie sie.
   6. Fügen Sie 3 Volumen (1,5 ml) MeOH hinzu und mischen Sie vorsichtig, aber gründlich, wobei Sie darauf achten, dass der undurchsichtige Proteinpfannkuchen nicht fragmentiert wird.
   7. Zentrifugieren Sie bei 3.000 x g für 10 min bei 25 °C in einem schwingenden Schaufelrotor.
   8. Entfernen Sie mit einer serologischen Glaspipette so viel wie möglich von der oberen Phase, ohne den Proteinpfannkuchen zu stören.
   9. Spülen Sie das Pellet vorsichtig mit 1 mL MeOH aus.
   10. Trocknen Sie das Pellet mindestens 10 Minuten lang an der Luft.
       HINWEIS: Getrocknete Pellets können bei -20 °C gelagert werden.
3. Führen Sie die Spaltung von Palmitoyl-Thioester-Bindungen mit Hydroxylamin (NH₂OH, HAM) durch.
   1. Das Proteinpräzipitat wird in 125 μl Puffer A resuspendiert und kurz beschallt. Zentrifugieren Sie bei >13.000 x g für 10 min bei 25 °C, um unlösliches Material zu entfernen. Übertragen Sie das gelöste Protein in ein neues 1,5-ml-Röhrchen.
   2. Fügen Sie 375 μl Puffer H (HAM+; Tabelle 1) oder Puffer T (HAM-; Tabelle 1) und inkubieren Sie die Proben 60 Minuten lang bei 25 °C.
4. Wiederholen Sie den in Schritt 2.2 beschriebenen CM-Niederschlag.
   HINWEIS: Getrocknete Pellets können bei -20 °C gelagert werden.
5. Fügen Sie mPEG zu ungeschützten Cysteinen hinzu.
   1. Das Pellet wird in 100 μl Puffer A mit 10 mM TCEP resuspendiert. In ein 1,5-ml-Röhrchen umfüllen.
      HINWEIS: Es ist normal, dass während der CM-Fällungsschritte ein signifikanter Proteinverlust aufgetreten ist. Alle nachfolgenden Schritte werden in einem 1,5-ml-Röhrchen durchgeführt, wobei das Proteinvolumen auf maximal ~120-130 μl begrenzt wird. Dadurch wird der Proteinverlust während der abschließenden CM-Fällung reduziert.
   2. 20 mM mPEG-5k (25 μl, zugegeben aus einer Stammlösung; Tabelle 1) in die Proteinprobe aufnehmen und durch Pipettieren mischen. 60 min bei 25 °C mit End-over-End-Rotation inkubieren.
   3. Um nicht eingebautes mPEG-5k zu entfernen, führen Sie die CM-Fällung wie in Schritt 2.2 beschrieben mit diesen angepassten Volumina durch: 4 Volumina MeOH (500 μL), 2 Volumina Chloroform (250 μL) und 3 Volumina dH₂O (375 μL). Zentrifugieren Sie bei >13.000 x g für 10 min bei 25 °C.
   4. Die obere Phase wie zuvor vorsichtig entfernen, dabei den dickflüssigen, flockigen Palatschinken aussparen. Fügen Sie 1 mL MeOH hinzu und mischen Sie vorsichtig, aber gründlich. Zentrifugieren Sie bei >13.000 x g für 10 min bei 25 °C.
   5. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und spülen Sie das Pellet mit 1 mL MeOH aus. Zentrifugieren Sie bei >13.000 x g für 10 min bei 25 °C und trocknen Sie das Granulat an der Luft.
      HINWEIS: Getrocknete Pellets können bei -20 °C gelagert werden.
   6. Das getrocknete Pellet wird in 50 μl Puffer A (ohne TCEP oder Reduktionsmittel) resuspendiert.

Ergebnisse

Tabelle 1: Für den APEGS-Assay verwendete Lösungen. Homogenisierungspuffer und Puffer A können im Voraus vorbereitet werden; Fügen Sie jedoch unmittelbar vor der Anwendung Proteasehemmer und Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) hinzu. Alle anderen Lösungen sollten frisch zubereitet werden.

Puffer

Komponenten

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Hydroxylamin (HAM)	ThermoFisher	26103
Methoxy-PEG-(CH2)3NHCO(CH2)2-MAL (mPEG)	NOF	ME-050MA	MW ~5000 kDa
Mikrofuge	Eppendorf	5415R	oder gleichwertige Ausrüstung
N-Ethylmalemid (NEM)	Calbiochem	34115	Hochgiftig
Optischer Imager für die Densitometrie	Azure Biosystems	Biomolekularer Saphir-Imager	oder gleichwertige Ausrüstung
Polypropylen-Tuben mit Kappe	Fischer Wissenschaftlich	14-956-1D
Serologische Pipetten (Glas)	Fischer Wissenschaftlich	13-678-27D
Zentrifuge	Beckman	Allegra X-15R	oder gleichwertige Ausrüstung
Tris(2-carboxyethyl)phosphinhydrochlorid (TCEP)	EMD Millipore	580560