Herstellung von Amyloid-Beta-freisetzenden Polymer-Mikrokügelchen zur Modellierung der Alzheimer-Krankheit

Zusammenfassung

Quelle: Almari, B., et al. Herstellung von Amyloid-β-sezernierenden Alginat-Mikrokügelchen zur Verwendung bei der Modellierung der Alzheimer-Krankheit. J. Vis. Exp. (2019).

Dieses Video zeigt ein Verfahren zur Herstellung von Polymer-Mikrokügelchen, die neurotoxische Amyloid-beta-sezernierende Zellen verkapseln. Die Zell-Polymer-Suspension wird durch eine Mikrokügelchen-Herstellungsvorrichtung verarbeitet, wobei die Polymergelierung durch Kalziumvernetzung erreicht wird, wodurch kugelförmige Mikrokügelchen um die Zellen herum gebildet werden. Das Polymer ermöglicht die Zellproliferation und ermöglicht gleichzeitig eine kontrollierte, langfristige Amyloid-Beta-Freisetzung, wodurch seine Akkumulation bei der Alzheimer-Krankheit simuliert wird.

Protokoll

1. Vorbereitungen

1. Bereiten Sie 100 ml ~4% (w/v) Alginat-Stammlösung vor.
   1. Wiegen Sie 4,4 g Alginat-Natriumsalz und geben Sie das trockene Pulver zu 100 mL HEPES-gepufferter Kochsalzlösung (HBS), 20 mM Hydroxyethylpiperazin-Ethansulfonsäure [HEPES] (0,477 g) mit 150 mM NaCl (0,877 g) in entionisiertem Wasser, um eine Hydratation zu ermöglichen.
   2. Verwenden Sie einen Magnetrührer mit ~500 Umdrehungen pro Minute (U/min) und erhitzen Sie ihn auf bis zu 50 °C, um eine vollständige Alginathydratation zu ermöglichen.
      Anmerkung: Das Alginat kann ein bis zwei Stunden brauchen, um vollständig hydriert zu sein. Um Zeit zu sparen, kann die Alginatlösung einen Tag vor dem Verkapselungsprotokoll hergestellt und bis zum nächsten Tag bei 4 °C gelagert werden. Nach dem Kühlen von Alginat mit einem Wasserbad oder einer Heizplatte schonend auf 37 °C erhitzen und unmittelbar vor Gebrauch mit einem Magnetrührer umrühren.
   3. Sterilfiltrieren Sie die Alginatlösung vor Gebrauch mit einem 0,22 μm Poren-Polyethersulfon (PES)-Filter. Die Filterung wird bei 37 °C empfohlen, um einen einfachen Fluss des Alginats zu ermöglichen. Die Viskosität steigt, wenn man die Temperatur sinken lässt.
2. Bereiten Sie 1.000 ml 0,5 m CaCl₂ vor.
   1. Wiegen Sie 55,49 g wasserfreies CaCl₂ und lösen Sie es in 1.000 mL HBS (20 mM HEPES und 150 mM NaCl in 1.000 mL deionisiertem Wasser).
   2. Sterilfilter mit einem PES-Filter mit 0,22 μm Poren.
3. Bereiten Sie 100 ml Auflösungsmischung vor.
   1. Bereiten Sie eine Lösung aus 100 mM HEPES (23,83 g) und 500 mM Trinatriumcitratdihydrat (147,05 g) in phosphatgepufferter Kochsalzlösung vor.
   2. Mit NaOH oder HCl auf pH 7,4 einstellen.

2. Einrichten des Kapselungssystems

1. Reinigen Sie die Laminar-Flow-Haube.
   1. Sterilisieren Sie die Laminar-Flow-Haube, die den Verkapselungskörper enthält, unter UV-Strahlung, gefolgt von einem Besprühen mit 70 % v/v Ethanollösung.
   2. Spülen Sie das Verkapselungssystem mit 10 mL 70 % v/v Ethanollösung, gefolgt von 10 mL sterilem deionisiertem Wasser.
   3. Bringen Sie die 300-μm-Düse an und wiederholen Sie Schritt 2.1.2.
   4. Besprühen Sie die Flasche mit der gefilterten Alginatlösung, die Flasche mit der gefilterten Calciumchloridlösung und alle Werkzeuge, Geräte und leeren Kulturplatten, die mit 70 % v/v Ethanollösung verwendet werden, und setzen Sie sie in die Laminar-Flow-Haube ein. Schalten Sie vor der Anwendung erneut ein UV-Licht für 30 Minuten ein, um es gründlich zu sterilisieren.
   5. Bereiten Sie ein mit einer biologischen Desinfektionslösung gefülltes Abfallbecherglas vor und setzen Sie das Becherglas in die Haube ein.
   6. Füllen Sie ein Becherglas mit 100 mL steriler CaCl₂ (wässriger) Lösung und geben Sie einen Magnetrührer hinzu. Stellen Sie die Rührgeschwindigkeit auf 100 U/min ein. Stellen Sie den Becher auf eine magnetische Plattform in einer Höhe von 18 cm von der Spitze der Düse. Dieser Becher wird verwendet, um Alginatkügelchen zu sammeln und ihre Gelierung zu ermöglichen.
2. Bereiten Sie die Zellen für die Verkapselung vor.
   1. Die Zellen werden aus dem Inkubator entnommen und mit 0,25 %iger Trypsin-Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)-Lösung aus dem nahezu konfluenten Kolben gelöst und 5-10 Minuten lang bei 37 °C inkubiert.
   2. Isolieren Sie eine Probe zur Schätzung der Zelldichte und zentrifugieren Sie dann die verbleibenden Zellen 5 Minuten lang bei 1.000 U/min, um ein Zellpellet zu erhalten.
   3. Resuspendieren Sie das Pellet in HBS (20 mM HEPES und 150 mM NaCl), um die gewünschte endgültige Zellkonzentration zu verdoppeln (z. B. für eine Endkonzentration von 1,5 x 10⁶ Zellen/ml resuspendieren Sie die Zellen in HBS, um eine Konzentration von 3 x 10⁶ Zellen/ml zu erreichen).
   4. Mischen Sie die Zellsuspension in einem 50-ml-Zentrifugenröhrchen im Verhältnis 1:1 mit ~4 % (w/v) Alginatlösung, um eine endgültige Suspension zu erhalten, die die gewünschte Zellkonzentration (z. B. 1,5 x 10⁶ Zellen/ml) in einer ~2 % (w/v) Alginatlösung enthält.
3. Legen Sie die Kapselungsparameter fest.
   1. Stellen Sie die Drehzahl der Verkapselungsmaschine auf die maximale Extrusionsgeschwindigkeit (8,9 mL/min), die Spannung auf 1,0 kV und die Frequenz auf 5.500 Hz ein.
      Anmerkung: Diese Parameter wurden zuvor optimiert, um Mikrokügelchen mit einem Durchmesser von 550 μm zu erhalten.

3. Herstellung

1. Stellen Sie die Mikrokügelchen her.
   1. Laden Sie in eine 20-ml-Spritze 5 ml der Zell-Alginat-Suspension und befestigen Sie eine Spritze an der Verkapselung.
   2. Starten Sie den Verkapselungssystem, indem Sie den Durchfluss aktivieren, der die Zell-Alginat-Suspension durch den Feeder drückt. Ein Strom von Tröpfchen wird durch die Düse extrudiert.
   3. Sammeln Sie die ersten 1 mL im Abfallbecherglas, um den anfänglichen ungleichmäßigen Strom zu vermeiden.
   4. Fahren Sie mit den restlichen 4 mL fort, sodass die Tröpfchen in das CaCl 2-Gelierungsbad fallen. Jeder Milliliter kann separat (aber nacheinander) betrieben und bei Bedarf in vier verschiedenen Gelierungsbädern gesammelt werden.
      Anmerkung: Bei Kontakt mit dem Gelierungsbad vernetzt sich das Alginat in den Tröpfchen sofort mit den Kalziumionen im Gelierungsbad und bildet kugelförmige Mikrokügelchen.
   5. Nach einer Minute nehmen Sie das Gelierungsbecherglas von der magnetischen Plattform und lassen Sie die Mikrokügelchen weitere 4 Minuten ohne Rühren ruhen (Zeit, die erforderlich ist, um eine vollständige Gelierung der Mikrokügelchen bei Raumtemperatur zu ermöglichen).
2. Holen Sie sich Mikrokügelchen.
   1. Entfernen Sie alle großen Alginatrückstände oder Artefakte mit einer sterilen Pinzette und geben Sie sie dann mit einer sterilen Kunststoffpipette in einen 74-μm-Netzfilter, um die Mikrokügelchen aus dem Gelationsbad zu holen.
   2. Übertragen Sie die Mikrokügelchen mit dem entsprechenden Nährmedium in ein Zentrifugenröhrchen und lassen Sie sie 5 Minuten lang im Zellkulturmedium äquilibrieren.
   3. In einen Kolben, eine Platte oder eine Petrischale zur Inkubation und für weitere Experimente umfüllen.
      Anmerkung: Das Gelationsbad sollte nicht wiederverwendet werden.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
0.22 um PES filter	Merck, Vereinigtes Königreich	SLGP033RS
15mm Netwell-Einsatz 74 μm Maschenfilter	Constar, USA	#3477
Alginsäure-Natriumsalz aus Braunalgen	Sigma-Aldrich,uk	A0682
Calciumchlorid	Sigma-Aldrich,uk	C1016
CellTiter96 AQueous One Solution Zellproliferationsassay	Promega, USA	G3580
Verkapselung	Inotech	IE-50	Serien-Nr. 05.002.01-2005
HEPES	Sigma-Aldrich,uk	H4024
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung	Sigma-Aldrich,uk	D1408
Natriumchlorid	Sigma-Aldrich,uk	433209
Trispdiumcitrat-Dihydrat	Sigma-Aldrich,uk	W302600-K
Trypsin-EDTA-Lösung	Sigma-Aldrich,uk	T4049