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Alle Verfahren, bei denen Tiermodelle zum Einsatz kommen, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und der Veterinärprüfung von JoVE überprüft
Hinweis: Beginnen Sie mit der Identifizierung der Ziel-Mauspopulation. In früheren Studien wurden nur männliche Wildtyp-Mäuse vom Typ C57/Bl6 verwendet. Es können aber auch verschiedene transgene oder Knockout-Mäuse verwendet werden. Beachten Sie, dass stereotaktische Koordinaten auf der Anatomie C57/Bl6 basieren. Es wird empfohlen, dass jeder Benutzer zunächst die Lokalisation des Strichs in der weißen Substanz überprüft.
1. Induktion eines Schlaganfalls der weißen Substanz - medial abgewinkelter Ansatz
- Beginnen Sie mit der Vorbereitung einer gezogenen Glaspipette mit einem 0,5 mm Kapillarröhrchen mit einem distalen Durchmesser zwischen 15 und 25 μm.
- Bereiten Sie ein steriles 10 μl Aliquot von L-Nio (N(5)-(1)-Iminoethyl-L-ornithinhydrochlorid) bei 27,4 mg/ml (130 μM) in steriler 0,9%iger normaler Kochsalzlösung vor.
- Füllen Sie die gezogene Glaspipette mit einem kleinen Volumen L-Nio (2-5 μl) vor, indem Sie die Glaspipette auf einen Schlauch aufbringen, der an eine Vakuumleitung angeschlossen ist. Legen Sie die Pipette flach auf die Tischplatte und führen Sie das gezogene Ende in die L-Nio-Lösung ein.
- Wenden Sie das Vakuum an, bis mindestens 2 mm des 0,5-mm-Teils der Pipette gefüllt sind. Schalten Sie das Vakuum aus und ziehen Sie die Pipette heraus. Legen Sie es bis Schritt 1.12 beiseite.
- Legen Sie die Maus in eine Induktionskammer und leiten Sie die Anästhesie der Maus mit standardmäßigem 32%igem Isofluran ein, das durch einen Verdampfer fließt (5 l/min inhaliert mit 5 l/min Sauerstoff und 0,5 l/min Stickstoff) für 1 Minute oder bis zur tiefen Anästhesie. Übertragen Sie die Maus auf ein stereotaktisches Gerät, das mit einem stereotaktischen Mikroskop ausgestattet ist. Bieten Sie eine Erhaltungsanästhesie mit 32 % Isofluran, das durch einen Verdampfer (2 l/min inhaliert mit 5 l/min Sauerstoff und 0,5 l/min Stickstoff) und einen Nasenkonus geströmt wird. Überprüfen Sie die Tiefe der Anästhesie mit einer Zehenklemme.
- Stellen Sie den Injektionsarm auf 36° ein.
- Befestigen Sie einen Pipettenhalter aus gezogenem Glas am distalen Ende eines Injektionssystems mit niedrigem Volumen und befestigen Sie ihn am Injektionsarm des stereotaktischen Aufbaus.
- Bestreichen Sie die Schnurrhaare des betäubten Tieres mit Vaseline und tragen Sie künstliche Tränensalbe auf beide Augen auf. Bereiten Sie ein steriles Operationsfeld vor, indem Sie ein steriles Abdecktuch über den Kopf des Tieres legen und eine Öffnung von 5-10 cm über den Kopf legen. Bereiten Sie eine aseptische Operationsfläche vor, indem Sie das Fell über dem Schädel rasieren. Reinigen Sie die Kopfhaut abwechselnd mit Betadin- und 70%igen Alkoholtupfern.
- Machen Sie mit einer sterilen feinen Schere einen 1,5 cm langen Schnitt in der Mittellinie, um die Schädeloberfläche freizulegen. Trocknen Sie den Schädel mit einem sterilen Wattestäbchen und entfernen Sie mit einem stereotaktischen Mikroskop bei 1-3-facher Vergrößerung das darüber liegende periostale Gewebe mit einem sterilen Mikropunktwerkzeug.
- Markieren Sie das Bregma mit einem feinen Punktmarker als Referenzpunkt.
- Bohren Sie eine 2 mm elliptische Kraniotomie mit einem sterilen chirurgischen Bohrer mit feinem Stiel, der posterior am Bregma beginnt und sich nach anterior knapp links von der Mittellinie erstreckt. Entfernen Sie Knochenfragmente und darüber liegendes Weichgewebe, damit die Großhirnrinde sichtbar gemacht werden kann.
- Halten Sie das Operationsfeld und die kortikale Oberfläche feucht, indem Sie intermittierend Tropfen steriler Kochsalzlösung auftragen.
- Befestigen Sie eine gezogene Glaspipette am Injektorarm des stereotaktischen Geräts. Richten Sie das distale Ende der Pipette am Bregma aus und setzen Sie die stereotaktischen Koordinaten auf Null.
- Schieben Sie die Pipette bis zu den ersten anterioren/posterioren (A/P) und medialen/lateralen (M/L) Koordinaten vor, die in Tabelle 1 angegeben sind.
- Schieben Sie die Pipette auf die kortikale Oberfläche und stellen Sie die dorsale/ventrale (D/V) Messung auf Null.
- Führen Sie die Pipette langsam in das Gehirn ein, bis Sie die erste D/V-Koordinate in Tabelle 1 erreichen.
- Injizieren Sie mit einem Injektionssystem mit niedrigem Volumen, das auf 20 psi für 20-ms-Impulse eingestellt ist, 100 nl L-Nio in das Gehirn und warten Sie 5 Minuten, um einen Rückfluss in der Pipettenspur zu verhindern.
- Verwenden Sie ein kalibriertes Absehen im Okular des stereotaktischen Mikroskops und eine 3-fache Vergrößerung.
- Dementsprechend verschiebe ich für jeden Koordinatensatz insgesamt 0,100 mm3 (0,5 mm Länge in einer Pipette mit einem Durchmesser von 0,5 mm, entsprechend 100 nl) von der gezogenen Glaspipette. Messen und standardisieren Sie mit einem Fadenkreuz, da jede Einrichtung je nach verwendeter Vergrößerung und Skala variiert.
- Für eine genaue Volumenmessung bei jeder Injektion nähern Sie sich der abgewinkelten Pipette mit dem Mikroskop von der Seite, so dass der Luft-Flüssigkeits-Meniskus eine sagittale Ansicht hat. Der Meniskus sollte in der gleichen Brennebene wie die Innen- und Außenwände der Pipette erscheinen.
- Ziehen Sie die Pipette langsam heraus und wiederholen Sie die Schritte 1.13-1.16.3 am zweiten und dritten Koordinatensatz in Tabelle 1.
- Entfernen Sie nach der letzten Injektion die Pipette und geben Sie so viel Knochenwachs, dass die Kraniotomiestelle gefüllt ist. Nähern Sie sich den Rändern der Kopfhautwunde und binden Sie sie mit Hautkleber.
- Injizieren Sie 0,1 ml 0,5 % Marcain mit einer sterilen 30-G-Nadel in die Wundränder, um lokale Schmerzen im Zusammenhang mit dem Kopfhautschnitt zu vermeiden.
- Das Tier wieder in den Stall bringen und postoperative Antibiotika (0,48 mg/ml Trimethoprim-Sulfamethoxazol oder 0,5 mg/ml Levofloxacin) 5 Tage lang in das Trinkwasser geben.
