Nachweis von Protein-Protein-Wechselwirkungen in Drosophila-Larven mit Hilfe eines Proximity-Ligationsassays

Zusammenfassung

Quelle: Wang, S., et al. Nachweis von In situ Protein-Protein-Komplexen an der Drosophila larvalen neuromuskulären Verbindung mittels Proximity-Ligationsassay. J. Vis. Exp. (2015).

Dieses Video demonstriert die Visualisierung von Protein-Protein-Wechselwirkungen an der neuromuskulären Verbindung (NMJ) von Drosophila mit Hilfe des Proximity Ligation Assay (PLA). Nach der Isolierung der Körperwände werden interagierende Proteine mit Primärantikörpern und PLA-konjugierten Sekundärantikörpern untersucht. Die Nähe der interagierenden Proteine erleichtert die Ligation von Sonden mit Konnektor-Oligonukleotiden, wodurch zirkuläre DNA gebildet wird, die dann durch Rolling-Circle-Amplifikation amplifiziert wird. Fluoreszierende Sonden binden an die amplifizierte DNA und ermöglichen so die Visualisierung von Protein-Protein-Wechselwirkungen am NMJ.

Protokoll

1. Vorbereitung der Körperwand

HINWEIS: Die Präparation der Körperwände der Larven im dritten Stadium (zur Untersuchung der NMJs, die die Körperwandmuskulatur innervieren) wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt, jedoch mit einigen Modifikationen.

1. Dissektion
   1. Ziehen Sie Fliegenbestände und Kreuzungen fünf bis sechs Tage lang bei 25 °C nach Standardverfahren auf.
   2. Entnehmen Sie kriechende Larven des dritten Stadiums mit einer feinen Pinzette aus Fläschchen oder Flaschen.
   3. Waschen Sie die Larven in einer kleinen Petrischale, die Phosphatpuffer-Kochsalzlösung (PBS) enthält, um alle Speisereste zu entfernen.
   4. Legen Sie eine einzelne Larve auf eine Sylgard-Scheibe und tauchen Sie sie in ein paar Tropfen eiskaltes PBS. Die Verwendung von eiskaltem PBS hilft, die Larve zu betäuben, wodurch sie leichter zu manipulieren ist. Achten Sie während der gesamten Dissektion darauf, dass das Präparat immer in PBS getaucht wird, um ein Austrocknen zu verhindern.
   5. Positionieren Sie die Larve mit der Rückenseite nach oben, so dass die beiden Trachealbahnen unter einem Präpariermikroskop sichtbar sind (Abbildung 1A). Greifen Sie mit der Pinzette eine winzige Nadel und stecken Sie die Larve am hinteren Ende in der Nähe der Spiracles fest (Abbildung 1B). Mit einer weiteren Nadel die Nagelhaut am vorderen Ende in der Nähe der Mundhaken durchstechen. Strecken Sie die Larve vorsichtig der Länge nach aus und stecken Sie sie dann fest (Abbildung 1B).
   6. Drücke mit einer Mikrodissektionsschere das hintere Ende in der Nähe der Nadel zusammen, um eine kleine Öffnung zu schaffen. Der Schnitt sollte oberflächlich genug sein, um gerade durch die Nagelhaut zu gehen.
   7. Setzen Sie die Spitze der unteren Klinge der Schere in den Schnitt ein und schneiden Sie entlang der gesamten Länge der dorsalen Mittellinie zwischen den beiden Trachealbahnen (Abbildung 1C). Richten Sie die Scherenklingen beim Schneiden leicht nach oben, um die Bauchwandmuskulatur nicht zu beschädigen.
   8. Machen Sie einen kleinen horizontalen Schnitt etwas vor dem posterior platzierten Stift (Abbildung 1C). Machen Sie einen weiteren ähnlichen Schnitt etwas hinter dem anterior platzierten Stift (Abbildung 1C). Die Schnitte sollten nur durch die Nagelhaut gehen.
      HINWEIS: Die drei Schnitte aus den Schritten 1.1.7 und 1.1.8 zusammen sollten einem "" ähneln, wenn sie abgeschlossen sind, , d.h. , sollte ein linker und rechter Lappen auf der dorsalen Seite des Larvenkörpers erzeugt werden.
   9. Reinige die inneren Organe vorsichtig mit der Pinzette. Die Zugabe von ein paar kräftigen Tropfen PBS hilft, die Organe aus dem Larvenkörper zu verdrängen und so ihre Entfernung zu erleichtern. Vermeiden Sie es, in den Larvenkörper zu stechen, da dies die Muskeln der Körperwand schädigt.
   10. Entfalten Sie den Larvenkörper und stecken Sie die Ecken fest (Abbildung 1D). Beim Stecken dehnst du die Körperwand sowohl horizontal als auch vertikal, um ein gleichmäßig gespanntes Rechteck zu bilden (siehe Abbildung 1G für die Form, wobei du darauf achtest, dass die Muskeln der Körperwand dabei nicht reißen.
   11. Beenden Sie die Entfernung aller verbleibenden inneren Organe (Abbildung 1E).
2. Fixierung und Permeabilisierung
   1. Tauchen Sie die festgesteckten Körperwände in mehrere Tropfen Bouin's Solution. 15 min auf Eis inkubieren. Alternativ können Sie 4% Paraformaldehyd (PFA) als alternatives Fixiermittel verwenden; 30 Min. inkubieren
   2. Dreimal mit Phosphatpuffer Kochsalzlösung mit Triton (PBT) spülen.
   3. Entfernen Sie mit einer feinen Pinzette vorsichtig die Stifte und geben Sie die Körperwände an ihren Ecken in ein silikonisiertes 0,65-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
   4. Lagern Sie die Körperwände in PBT bei 4 °C, bis sie für PLA bereit sind. Um optimale Ergebnisse zu erzielen, beginnen Sie innerhalb von ein oder zwei Tagen nach der Dissektion mit der Immunfärbung der Körperwände.
      HINWEIS: Um Reagenzien zu sparen und sicherzustellen, dass alle Körperwände während des Assays gleich behandelt werden, können verschiedene Genotypen in ein einziges Röhrchen gegeben werden. Genotypen können unterschieden werden, indem die Ecken der Körperwände unterschiedlich geschnitten werden (siehe z.B. Abbildung 1F).

2. Immunhistochemie

HINWEIS: Die Immunfärbung der Körperwände der Larven des dritten Stadiums wurde wie zuvor beschrieben, jedoch mit einigen Modifikationen durchgeführt.
HINWEIS: Führen Sie alle Schritte bei Raumtemperatur und unter leichtem Rühren durch, sofern nicht anders angegeben.

1. Blockierend
   1. Waschen Sie die Körperwände dreimal für jeweils 10 Minuten mit PBT.
   2. Mit 1% Rinderserumalbumin (BSA) für 1 Std. blockieren
2. Immunfärbung
   1. Inkubieren Sie die Körperwände mit Maus- und Kaninchen-Primärantikörpern gegen die beiden interessierenden Proteine (verdünnt in 1 % BSA) für 2 Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 °C. Verwenden Sie in diesem Fall 1:10 Maus Anti-Dlg (Dlg = Scheiben groß) und 1:250 Kaninchen Anti-HtsM (HtsM: Hu-li tai shao Mutante). Antikörper gegen Marker, die nicht in Maus oder Kaninchen hergestellt werden, können ebenfalls enthalten sein — z.B. , verwenden Sie 1:200 Ziegen-Anti-Hrp (Hrp = Meerrettichperoxidase), um die neuronalen Membranen abzugrenzen.
   2. Dreimal für jeweils 10 Minuten mit PBT waschen.
   3. Inkubieren Sie mit Fluorophor-konjugierten Sekundärantikörpern zum Nachweis der Marker (verdünnt in 1 % BSA) für 2 Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 °C. Da das PLA-Signal später mit einem roten Fluorophor visualisiert wird, muss ein anderer Fluorophor verwendet werden, um den Marker zu detektieren — , z. B. , verwenden Sie 1:200 Fluorescein-Isothiocyanat (FITC)-konjugiertes Anti-Ziegen-Antikörper, um den Ziegen-Anti-Hrp-Antikörper nachzuweisen. Durch die Verwendung von lichtempfindlichen Reagenzien sollten Sie die Röhren ab diesem Zeitpunkt im Dunkeln halten.
      HINWEIS: Das verwendete Kit ermöglicht die Durchführung von PLA zwischen primären Antikörpern, die in Maus und Kaninchen gezüchtet wurden, wobei das Signal auf dem roten Kanal unter konfokaler Mikroskopie sichtbar gemacht wird. Falls gewünscht, sind andere Kits erhältlich, die es ermöglichen, den Assay mit Primärantikörpern durchzuführen, die in anderen Spezies aufgezogen wurden, und das Signal auf anderen Kanälen zu visualisieren.

3. Proximity-Ligatur-Assay

HINWEIS: Führen Sie alle Schritte bei Raumtemperatur und unter leichtem Rühren durch, sofern nicht anders angegeben.

1. PLA-Sonden
   1. Waschen Sie die Körperwände dreimal für jeweils 10 Minuten mit PBT.
   2. Mit PLA-Sonden (1:5 Verdünnung in je 1 % BSA) 2 Stunden lang bei 37 °C inkubieren. Verwenden Sie in diesem Fall 40 μl PLA-Sonde Anti-Maus MINUS, 40 μl PLA Sonde Anti-Kaninchen PLUS und 120 μl 1% BSA, um das richtige Eintauchen und Mischen von 5-10 Körperwänden zu gewährleisten. Bis zu einer Verdünnung von 1:25 der PLA-Sonden kann immer noch ein adäquates Signal-Rausch-Verhältnis ergeben (d.h. , für dieses Experiment).
2. Gebundenheit
   1. Waschen Sie die Körperwände zweimal für jeweils 5 min mit Waschpuffer A.
   2. Inkubieren Sie mit Ligationslösung (1:40 Verdünnung von Ligase in Ligationspuffer) für 1 Stunde bei 37 °C. Verwenden Sie in diesem Fall 5 μl Ligase, 40 μl 5 Ligationspuffer und 155 μl hochreines Wasser, um das richtige Eintauchen und Mischen von 5-10 Körperwänden zu gewährleisten.
3. Verstärkung
   1. Waschen Sie die Körperwände zweimal für jeweils 2 min mit Wash Buffer A.
   2. Inkubieren Sie mit Amplifikationslösung (1:80 Verdünnung der Polymerase im Amplifikationspuffer) für 2 Stunden bei 37 °C. Verwenden Sie in diesem Fall 2,5 μl Polymerase, 40 μl 5 Amplifikationspuffer und 157,5 μl hochreines Wasser, um das richtige Eintauchen und Mischen von 5-10 Körperwänden zu gewährleisten.
4. Vorbereitung für die Bildgebung
   1. Waschen Sie die Körperwände zweimal für jeweils 10 min mit Waschpuffer B.
   2. Mit 0,01x Waschpuffer B einmal 1 Min. waschen.
   3. Vor dem Einbetten mindestens 30 Minuten lang in einigen Tropfen Einbettlösung äquilibrieren oder über Nacht bei 4 °C lagern.
   4. Übertragen Sie die Körperwände mit einer feinen Pinzette vorsichtig mit der Nagelhaut nach unten auf einen Objektträger. Positionieren Sie die Körperwände in Reihen und in der gleichen Ausrichtung innerhalb von ein oder zwei Tropfen Eindeckmittel. Legen Sie ein Deckglas 22 mm x 40 mm über das Präparat, achten Sie darauf, dass keine Luftblasen entstehen, und versiegeln Sie das Objektträger mit klarem Nagellack.
   5. Lagern Sie die Objektträger im Dunkeln bei -20 °C, bis sie für die konfokale Bildgebung bereit sind.

Ergebnisse

Abbildung 1: Präparation der Körperwände der Larven des dritten Stadiums. (A-F) Schematische Zeichnungen, die eine Körperwand-Dissektion darstellen. (A) Setze eine einzelne Larve mit der Rückenseite nach oben auf eine Sylgard-Scheibe, so dass die beiden Trachealbahnen sichtbar sind. (B) Stecke die Larve am vorderen und hinteren Ende mit winzigen Stecknadeln fest, Da...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Pinzette (fein #5)	Almedic	Nr. A10-704
Sylgard-Scheibe	Welt Präzisionsinstrumente	SYLG184	Elastomerbasis und Härter im Verhältnis 10:1 mischen. Auf 30 Min. einstellen. In eine Form gießen (z. B. eine 12-Well-Zellkulturplatte verwenden). Mindestens 24 Stunden aushärten lassen. Kleben Sie beim Präparieren auf den Deckel eines 60x15mm Petrischalendeckels.
Minutien Pins (0,0125 mm Spitzendurchmesser)	Feine wissenschaftliche Werkzeuge	26002-10
Mikrodissektionsschere (ultrafein)	Werkzeuge der Feinforschung	15200-00
Plattform-Folien			Kleben Sie zwei 22x22 mm Deckgläser mit klarem Nagellack auf einen Objektträger und lassen Sie einen Abstand von <20 mm dazwischen für die Probenmontage.
w1118	Bloomington Drosophila Stock Center	3605
hts01103	Bloomington Drosophila Stock Center	10989	Der Stamm wurde über einen GFP-Balancer neu ausbalanciert, so dass homozygote Mutanten basierend auf dem Fehlen eines GFP-Signals ausgewählt werden können.
1x PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung): 3 mM NaH2PO4, 7 mM Na2HPO4, 130 mM NaCl, pH 7,0			NaH2PO4 (Caledon Laboratories - 8180-1), Na2HPO4 (Caledon - 8120-1), NaCl (Caledon - 7560-1)
Bouins Lösung	Sigma-Aldrich	HT10132
4% PFA (Paraformaldehyd): 4% PFA in 1x PBS			PFA (Anachemia Science - 66194-300). Siehe doi:10.1101/pdb.rec9959 Cold Spring Harb Protoc 2006 für Anweisungen, wie die Lösung hergestellt wird.
1x PBT (Phosphatgepufferte Kochsalzlösung mit Triton): 1x PBS mit 0,01% Triton			Triton X-100 (Sigma-Aldrich - T8787)
1% BSA (Rinderserumalbumin): 1% BSA in 1x PBT			BSA (Bioshop Kanada - ALB001). Bei 4 °C lagern.
Maus-Anti-Dlg (Scheiben groß)	Entwicklungsstudien Hybridoma Bank	4F3	In einer Verdünnung von 1:10 in 1% BSA verwenden.
Kaninchen Anti-HtsM (Hu-li tai shao)			Zur Verfügung gestellt von Dr. Lynn Cooley (Yale University). In einer Verdünnung von 1:250 in 1% BSA verwenden.
Kaninchen-Anti-Pak (p21-aktivierte Kinase)			Zur Verfügung gestellt von Dr. Nicholas Harden (Simon Fraser University). In einer Verdünnung von 1:500 in 1% BSA verwenden.
Maus-Anti-Wg (Flügellos)	Entwicklungsstudien Hybridoma Bank	4D4	In einer Verdünnung von 1:5 in 1% BSA verwenden.
Anti-Hrp für Ziegen (Meerrettichperoxidase)	Jackson Immunforschung	123-065-021	In einer Verdünnung von 1:200 in 1 % BSA verwenden.
FITC-konjugierter Esel Anti-Ziege	Jackson ImmunForschung	705-095-003	In einer Verdünnung von 1:200 in 1 % BSA verwenden.
Duolink In Situ PLA Sonde Anti-Maus MINUS	Sigma-Aldrich	DUO92004
Duolink In Situ PLA Sonde Anti-Kaninchen PLUS	Sigma-Aldrich	DUO92002
Duolink In Situ Detektionsreagenzien Rot	Sigma-Aldrich	DUO92008
1x Waschpuffer A: 0,01 M Tris, 0,15 M NaCl, 0,05 % Tween 20, pH 7,4	Sigma-Aldrich	DUO82049	Tris (Caledon Laboratories - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1), Tween 20 (Fisher Scientific - BP337)
1x Waschpuffer B: 0,2 M Tris, 0,1 M NaCl, pH 7,5	Sigma-Aldrich	DUO82049	Tris (Caledon Laboratories - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1)
0,01x Waschpuffer B: 2 mM Tris, 1 mM NaCl, pH 7,5	Sigma-Aldrich	DUO82049	Tris (Caledon Laboratories - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1)
Duolink In-situ-Einbettmedium mit DAPI	Sigma-Aldrich	DUO82040