Bestimmung des Calciumretentionsvermögens isolierter Mitochondrien

Zusammenfassung

Quelle: Li, W., et. al. Mitochondrialer Ca2+-Retentionskapazitätsassay und Ca2+-getriggerter mitochondrialer Schwellungsassay. J. Vis. exp. (2018)

Dieses Video zeigt das Verfahren zur Beurteilung der mitochondrialen Kalziumretentionskapazität durch Überwachung von Echtzeitänderungen der Fluoreszenz bei der Kalziumaufnahme der Mitochondrien. Dieser Assay ist nützlich für die Untersuchung der mitochondrialen Funktion und kalziumbezogener Prozesse, einschließlich Apoptose und neurodegenerativer Erkrankungen.

Protokoll

1. Bestimmung der mitochondrialen Ca²⁺ Retentionskapazität

1. Bereiten Sie das KCl-Medium vor (125 mM KCl (Kaliumchlorid), 2 mM K₂HPO₄ (Dikaliumphosphat), 1 mM MgCl₂ (Magnesiumchlorid), 20 mM HEPES (2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethansulfonsäure), 5 mM Glutamat, 5 mM Malat und 2 μM Rotenon, pH 7,4) und fügen Sie den Ca²⁺-bindenden grünen Fluoreszenzfarbstoff vor dem Experiment bis zu einer Endkonzentration von 0,5 μM hinzu.
2. 1 ml isolierter Mitochondrien (0,4 mg/ml) in KCl-Medien mit 0,5 μM Ca²⁺-bindendem grünen Fluoreszenzfarbstoff in jede 6-Well-Plattenvertiefung übertragen.
3. Inkubieren Sie die Mitochondrien und den Ca²⁺-bindenden grünen Fluoreszenzfarbstoff in der 6-Well-Platte bei Raumtemperatur und geschützt vor Umgebungslicht für 1 min. Geben Sie 4 μl Aliquots einer 20 mM CaCl₂ (Calciumchlorid)-Lösung (20 mM CaCl₂, 127 mM KCl, 1 mM MgCl_2, 20 mM HEPES, 5 mM Glutamat, 5 mM Malat, pH 7,4) in jede 6-Well-Plattenvertiefung unter Verwendung der automatischen Dispenseinstellung, um 200 nmol Ca²⁺/mg mitochondriales Protein zuzuführen.
4. Verwenden Sie ein Fluoreszenzspektrometer, um die Fluoreszenzänderungen alle 3 s für 2 min mit einer Anregungswellenlänge von 506 nm und einer Emissionswellenlänge von 531 nm zu überwachen. Die Platte ist mit einem Schütteln bei 600 U/min für 3 s zwischen den von der Software gesteuerten Messwerten ausgestattet (Abbildung 1).
5. Geben Sie zusätzlich 4 μl aliquot von 20 mM CaCl₂ Lösung in jede Vertiefung und überwachen Sie die Fluoreszenzänderungen alle 3 s für 2 Minuten. Wiederholen Sie diesen Schritt, bis die Fluoreszenz mit der Zeit zunimmt.
   HINWEIS: Mitochondrien werden mit dem hinzugefügten Ca²⁺ herausgefordert, was durch die erhöhte Fluoreszenz der Aufzeichnung angezeigt wird. Wenn sich die mPTP (mitochondriale Permeabilitätsübergangspore) öffnet, nimmt die Fluoreszenz mit der Zeit zu.
6. Interpretieren Sie die Gesamtmenge an Ca²⁺, die bis zum Öffnen des mPTP hinzugefügt wurde, als Ca²⁺ Retentionskapazität.

Ergebnisse

Abbildung 1: Die Softwareeinstellungen für den mitochondrialen Ca2⁺-Retentionskapazitätsassay.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Kalziumgrün-5N	Lebenstechnologien	c-3737	Calcium-bindender grüner Fluoreszenzfarbstoff
Glutamat	Sigma-Aldrich	RES5063G-A7
Malat	Sigma-Aldrich	46940-U
Rotenon	Sigma-Aldrich	Nr. R8875
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Magnesiumchlorid	Sigma-Aldrich	457
Dikaliumphosphat	Sigma-Aldrich	V900050
KCl	Sigma-Aldrich	P9541
Calciumchlorid	Sigma-Aldrich	V900266