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Alle Verfahren, bei denen Tiermodelle zum Einsatz kommen, wurden vom örtlichen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss der JoVE überprüft.
1. Vorbereitung von mikroosmotischen Pumpeninfusionssystemen
HINWEIS: Bereiten Sie die Pumpe, den Puffer für die künstliche Zerebrospinalflüssigkeit (aCSF) und das Medikament (Met-CCL5/RANTES-Proteinlösung (10 ng/ml in aCSF)) unter sterilen Bedingungen mit Puffern vor, die mit 0,2-μm-Filtern filtriert sind, und führen Sie alle Eingriffe unter der Kulturhaube mit Handschuhen durch. Die chirurgischen Eingriffe werden wie folgt durchgeführt:
- Bereiten Sie die mikroosmotischen Pumpen einen Tag vor der Operation vor: Füllen Sie die mikroosmotische Pumpe des Gehirns mit künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit (aCSF) mit einer 1-ml-Spritze und einer stumpfen Nadel, die zusammen mit dem Kit geliefert werden. Tauchen Sie die Mikroosmosepumpe in aCSF und stellen Sie sie über Nacht unter leichtem Schütteln auf einen Shaker.
VORSICHT: Die Pumpe sollte mit aCSF gefüllt sein, und Luftblasen im Inneren der Pumpe sollten vermieden werden (Abbildung 1A).
- Vor Beginn der Operation ist die rekombinante Met-CCL5/RANTES-Proteinlösung (10 ng/ml, verdünnt in aCSF) für das Experiment vorzubereiten. Entfernen Sie aCSF aus der Pumpe und füllen Sie die Pumpe langsam mit der Arzneimittellösung, bis überschüssiges Wasser austritt.
HINWEIS: 15 mL aCSF oder Met-CCL5/RANTES Lösung ist ausreichend für 5-8 Pumpstöße.
ACHTUNG: Wiederholen Sie den Vorgang, um sicherzustellen, dass die Pumpe vollständig mit dem Medikament gefüllt ist, ohne Blasen im Inneren.
- Schneiden Sie die Katheterschläuche in die gewünschte Länge und befestigen Sie sie an der stumpfen Hirninfusionsnadel des Gehirninfusionssets. Füllen Sie das Infusionsset und die Schläuche mit dem Medikament.
- Bauen Sie abschließend das Gehirninfusionsset zusammen und befestigen Sie es an der Mikroosmosepumpe.
ACHTUNG: Es sollten sich keine Blasen im Schlauch oder in der Pumpe bilden (Abbildung 1A).
- Tauchen Sie das gesamte osmotische Pumpen-Hirn-Fusionsset in aCSF in ein sterilisiertes 50-ml-Röhrchen, um ein Austrocknen der Pumpe zu verhindern. Das osmotische Pumpe-Hirn-Fusionsset ist nun bereit für den Einsatz in der Operation.
HINWEIS: Die mikroosmotischen Pumpensysteme können für die langfristige Infusion von Medikamenten verwendet werden. Dies gewährleistet eine sichere und bequeme Art der Verabreichung von Medikamenten in das Gehirn der Maus.
2. Intrazerebrale ventrikuläre Chirurgie – Implantation der Mikroosmosepumpe
VORSICHT: Sterilisieren Sie die chirurgische Umgebung mit 75%igem Ethanol und stellen Sie sicher, dass die an der Studie beteiligten Personen sterile Handschuhe und einen sauberen Laborkittel tragen. Chirurgische Instrumente/Instrumente müssen vor der Verwendung autoklaviert und getrocknet und anschließend zwischen den Mäuseoperationen mit 75 % Ethanol sterilisiert werden.
- Wiegen Sie die Maus und betäuben Sie sie durch intraperitoneale Injektion (IP) mit Ketamin/Xylazin (Ketamin 50 mg/kg, Xylazin 10 mg/kg).
VORSICHT: Mäuse mit einem Körpergewicht von weniger als 24 g werden für die Implantation mit osmotischen Pumpen nicht empfohlen.
- Montieren Sie den Mauskopf und befestigen Sie ihn auf dem stereotaktischen Gerät (Abbildung 1B).
- Schneide mit einer chirurgischen Schere und einer Zange die Außenhaut auf, die den Schädel bedeckt. Verwenden Sie Jod, um den peripheren Schädel zu reinigen.
- Trennen Sie die äußerste Hautschicht von der subkutanen Haut mit Hilfe einer stumpfen Zange in der Nähe der Halsregion für die Implantation des osmotischen Pump-Hirn-Fusionssets (Abbildung 1C).
- Markieren Sie den Infusionspunkt in Bezug auf die Gehirnkarte (Abbildung 1D) mit dem stereotaktischen Gerät. In diesem Experiment muss die Nadel in den Ventrikelbereich von 3rd implantiert werden (Bregma: 0,0 mm lateral, 1,3 mm posterior, 5,7 mm ventral).
- Bohren Sie mit einem Nagelbohrer ein Loch um die auf dem Schädel markierte Stelle (Abbildung 1E).
VORSICHT: Seien Sie vorsichtig, die Hirnhäute und Blutgefäße der Maus nicht zu beschädigen, um die Störung der Mikroblutgefäße im Gehirn zu vermeiden.
- Legen Sie das mikroosmotische Pump-Hirn-Fusionsset, das aCSF (als Kontrolle) oder Medikament (Met-CCL5/RANTES-Proteinlösung) enthält, unter die Haut hinter der Halsregion und führen Sie die Gehirninfusionsnadel in das Bohrloch ein, um das Medikament in das Gehirn der Maus zu infundieren (Abbildung 1E). Die Nadel dringt in die Hirnhäute ein und gelangt in die Herzkammer. Fixieren Sie die Nadel mit einem oberflächendesensibilisierenden Gel (Abbildung 1F) und warten Sie 1-2 Minuten, bis der Kleber getrocknet ist. Schneiden Sie dann den überstehenden Teil oben auf der Nadel ab (Abbildung 1G-H).
- Verwenden Sie einen Gewebekleber, um die Operationswunde am Kopf zu heilen. Tragen Sie 50 μl des Klebers auf die Wunde auf, ziehen Sie beide Seiten der Haut zusammen und halten Sie ihn 30 s lang gedrückt, damit die Haut dicht werden kann (Abbildung 1I).
VORSICHT: Verwenden Sie ein 100%iges Alkoholpad, um die Wunde nach der Operation zu reinigen, und 100 ul Penicillin mit Streptomycin, um eine Infektion zu verhindern. HINWEIS: Die Haut von Mäusen bildet Narbengewebe und heilt innerhalb weniger Tage nach der Verabreichung des chirurgischen Klebers. Der Hauptvorteil des Klebers ist die Vermeidung von chirurgischen Nähten, die Hautreizungen oder Entzündungen verursachen können.
- Stellen Sie die Maus in einen sauberen Käfig, der auf einer warmen Platte (auf 37 °C erhitzt) aufbewahrt wird, und warten Sie, bis sich die Maus von der Betäubungswirkung erholt hat.
VORSICHT: Es ist wichtig, die Körpertemperatur der Maus zu halten, um die Überlebenschancen nach der Operation zu erhöhen.
- Nach einer einwöchigen Erholungsphase sind die Mäuse bereit für weitere Experimente, wie z. B. den oralen Glukosetoleranztest (OGTT) und den Insulintoleranztest (ITT).
3. Oraler Glukosetoleranztest (OGTT)
HINWEIS: Führen Sie den oralen Glukosetoleranztest 7 Tage nach der Infusion von aCSF und MetCCL5/RANTES (10 ng/ml, 100 μL) durch. Halten Sie ein 6-stündiges Fasten für die Mäuse vor dem OGTT mit ausreichender Wasserversorgung aufrecht. Halten Sie die Tiere auf derselben Werkbank, an der die Experimente durchgeführt werden, damit sie sich an die Umgebung gewöhnen können, um den Stress während des Eingriffs zu reduzieren.
- Zubereitung der Glukoselösung: Bereiten Sie vor der Durchführung des Experiments die Glukoselösung vor, indem Sie 3,75 g Glukose in 15 ml destilliertem H2O auflösen.
- Richten Sie einen Zeitplan ein, um die Messwerte während des Versuchsverfahrens aufzuzeichnen (Tabelle 1).
HINWEIS: Es ist wichtig, einen Zeitplan mit angemessenen Abständen zwischen den einzelnen Blutuntersuchungen aufzustellen, um eine genaue Aufzeichnung während des Experiments zu ermöglichen.
- Wiegen Sie jede Maus nach dem Fasten und berechnen Sie die geeignete Menge an Glukose, die injiziert werden soll. Wenn die Maus beispielsweise 30 g wiegt, sollte die Menge der zu verabreichenden Glukoselösung 300 μl betragen.
- Bereiten Sie folgende Instrumente an der Werkbank vor:
- Blutzuckermessgerät (Drücken Sie die Starttaste, um den Batteriestatus zu überprüfen; stellen Sie vor dem Test sicher, dass es funktioniert.)
- Glukose-Chip
- Insulinspritze (0,3 mL Insulinspritze)
- Rasierklingen
- Timer
- Sobald die Bank eingerichtet ist, messen und protokollieren Sie den Blutzuckerspiegel wie folgt: Setzen Sie einen sauberen und neuen Glukosechip in das Blutzuckermessgerät ein und drücken Sie die Starttaste, um ihn auf Null zu setzen.
- Nehmen Sie die Maus am Nacken und streichen Sie ein paar Mal über den Schwanz, um eine ausreichende Durchblutung der Schwanzregion zu gewährleisten.
- Mit einer neuen Rasierklinge schneidest du ein kleines Stück des Schwanzes ab und drückst einen kleinen Tropfen Blut (ca. 10-20 μl) in den Glukosechip heraus. Das Blut sollte den Chip füllen, um eine genaue Messung zu ermöglichen. Das Blutzuckermessgerät zeigt sofort den Glukosespiegel an. Wenn das Gerät einen "Fehler" anzeigt, wiederholen Sie den Vorgang mit einem neuen Glukosechip.
HINWEIS: Der Glukosechip benötigt nur einen Tropfen Blut. Wenn die Blutprobe mehr als einmal entnommen werden muss, üben Sie einfach Druck aus, indem Sie mit den Fingern mehrmals über den Schwanz der Maus fahren, während Sie das Ende des Schwanzes direkt auf den Chip halten, um Blut zu sammeln. Es ist nicht notwendig, bei der Entnahme von Blutproben jedes Mal das Schwanzende abzuschneiden.
- Füttern Sie die Mäuse anschließend oral mit Glukose (0,25 g/ml) mit der intragastrischen Sondentechnik. Die zu verabreichende Glukosemenge sollte nach folgender Formel berechnet werden: 10X Körpergewicht (KG) μl Glukoselösung (wenn die Maus beispielsweise 30 g wiegt, beträgt die zu verabreichende Menge der Glukoselösung 300 μl). Starten Sie den Timer unmittelbar nach der Verabreichung von oraler Glukose.
- Wiederholen Sie den Glukosemessvorgang nach 15, 30, 60, 90 und 120 Minuten.
- Nachdem alle Glukosewerte aufgezeichnet wurden, entsorgen Sie die Rasierklingen und Glukosechips in einem Behälter für biologische Gefahren. Legen Sie das Futter zurück in die Mäusekäfige und bringen Sie sie in den Tierraum zurück.
Tabelle 1. Zeitplan für die Aufzeichnung des oralen Glukosetoleranztests (OGTT)
| # | Maus-ID | Körper | Glukose | Start | 0 | 15 | 30 | 60 | 90 |
| | Gewicht | μL =10xBW | Zeit | Minuten | Minuten | Minuten | Minuten | Minuten |
| 1 | 501 | 25.8g | 258 | 9:00 | 9:00 | 9:00 | 9:15 | 9:30 | 10:00 Uhr |
| 2 | 502 | 25.3g | 253 | 9:07 | 9:07 | 9:07 | 9:22 | 9:37 | 10:07 |
