Experimentelle Glaukom-Induktion über Iridokornealwinkelobstruktion in einem Mausmodell

Zusammenfassung

Quelle: Bunker, S., et al. Experimentelles Glaukom, das durch okuläre Injektion von magnetischen Mikrosphären induziert wird. J. Vis. Exp. (2015)

In diesem Video wird eine anästhesierte Ratte einem Augeneingriff unterzogen, bei dem magnetische Kügelchen unter einem Magnetfeld in die Vorderkammer injiziert werden, um den Iridokornealwinkel zu blockieren. Diese Blockade verstopft das Trabekelwerk, verhindert den Abfluss des Kammerwassers und führt zu einem erhöhten Augeninnendruck, wodurch die Ganglienzellen der Netzhaut und der Sehnerv geschädigt werden. Dabei entwickelt sich ein glaukomähnlicher Zustand.

Protokoll

Alle Verfahren, bei denen Tiermodelle zum Einsatz kommen, wurden vom örtlichen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss der JoVE überprüft.

1. Induktion der okulären Hypertonie

1. Induktion eines experimentellen Glaukoms durch Erhöhung des Augeninnendrucks (IOD) durch einseitige Injektion von paramagnetischen Mikrosphären in die Vorderkammer von Braunen Ratten. Andere pigmentierte Ratten könnten geeignet sein, obwohl der Benutzer sie zuerst validieren müsste.
2. Halten Sie 250-300 g weibliche Ex-Züchterratten in einer konstanten Umgebung mit wenig Licht (40-60 Lux), um tägliche Schwankungen des Augeninnendrucks zu minimieren, mit Zugang zu Futter und Wasser.
3. Nehmen Sie vor der Anästhesie und der Injektion von Kügelchen den Augeninnendruck bei wachen Tieren8 mit einem Rebound-Tonometer vor, das für die Verwendung im Rattenauge kalibriert ist9. Der IOD wird als Mittelwert von fünf Messwerten genommen.
4. Anästhesieren Sie Ratten mit 37,5 mg/kg Ketamin und 0,25 mg/kg Medetomidinhydrochlorid, das intraperitoneal verabreicht wird. Bestätigen Sie die Narkosetiefe, indem Sie die hinteren Fußreflexe des Tieres vor der Povidon-Jod-Applikation (siehe Schritt 1.5) und der Bead-Injektion (siehe Schritt 1.8) testen. Verabreichen Sie 0,5% Proparacainhydrochlorid zur Analgesie.
   HINWEIS: Erweitern Sie die Pupille zu keinem Zeitpunkt. Dies hilft den Kügelchen, sich besser im Hornhautwinkel abzusetzen und verhindert eine Bindung an die Linse. Tragen Sie eine Augensalbe auf, um ein Austrocknen der Hornhaut auf dem nicht operierten kontralateralen Auge zu verhindern.
5. Waschen Sie das operative Auge 5 Minuten vor der Injektion mit 5% Povidon-Jod in Wasser.
6. Nach 5 Minuten das Povidon-Jod mit steriler Gaze ableiten und das Auge mit 0,9%iger steriler Kochsalzlösung waschen. Halten Sie das Auge während der Anästhesie feucht mit regelmäßiger Anwendung von steriler Kochsalzlösung.
7. Platzieren Sie einen toroidalen Magneten um das Auge.
8. Injizieren Sie 25 μl einer Lösung, die 30 mg/ml gammabestrahlte, sterilisierte 8 μm magnetische Mikrosphären in Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) enthält, mit einer abgeschrägten 33-G-Nadel in die vordere Kammer.
   1. Um die Kügelchen herzustellen, waschen Sie sie, indem Sie sie erneut aufwirbeln, und zentrifugieren Sie sie dann 3 Mal bei 10.000 x g für 5 Minuten mit 1 ml HBSS, bevor Sie die endgültige 30 mg/ml-Lösung herstellen. Halten Sie durchgehend sterile Bedingungen aufrecht.
   2. Achten Sie bei der Injektion darauf, dass die Nadel nicht in die Iris eingeführt wird, um das Risiko eines Iristraumas zu minimieren. Dies kann verhindert werden, indem die Nadel tangential zur Hornhautoberfläche, so parallel wie möglich zur Iris, ausgerichtet wird. Dies trägt auch dazu bei, den Raupenverlust an der Injektionsstelle zu minimieren.
      HINWEIS: Injizieren Sie die Kügelchen mit einer schnellen Geschwindigkeit, um eine gleichmäßige Verteilung um den Iridokornealwinkel zu gewährleisten, was für die Erhöhung des Augeninnendrucks entscheidend ist. Bewahren Sie außerdem Kügelchen, Nadeln und Magnetringe getrennt auf, damit die Kügelchen keine Cluster bilden, was das Laden in die Spritze und die Injektion erschwert und die Nadel nicht magnetisiert wird.
9. Lassen Sie die Nadel 1 Minute nach der Injektion an Ort und Stelle, um sicherzustellen, dass sich die Kügelchen im Iridokornealwinkel absetzen und die wässrige Drainage aus dem Trabekelwerk behindern. Winkeln Sie die Nadel leicht an, nachdem sich die Kügelchen anfänglich abgesetzt haben, um ein gewisses Austreten von wässrigem Wasser zu ermöglichen und vorübergehende Erhöhungen des Augeninnendrucks zu minimieren. Am Ende der Operation spülen Sie die Nadel zuerst mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), dann mit 70 % Ethanol und anschließend mit destilliertem Wasser durch, um sicherzustellen, dass die Nadel in separaten Verfahren weiterhin verwendet wird. Alternativ kann man auch Einwegnadeln verwenden, wenn die richtige Kombination aus Stärke und Spritze zur Verfügung steht. Optional: Die Nadeln können mit einem Anfasmesser geschärft werden, um ihre Verwendung zu verlängern.
10. Entfernen Sie zu diesem Zeitpunkt bei Bedarf den Magneten und ziehen Sie damit Perlen in Bereiche mit unvollständiger Abdeckung.
11. Lassen Sie den Magneten weitere 10 Minuten nach der Injektion um das Auge herum, um sicherzustellen, dass sich die Kügelchen gut im Iridokornealwinkel absetzen.
12. Umkehranästhesie mit 0,25 mg/kg Atipemezolhydrochlorid.
13. Verabreichen Sie Chloramphenicol oder eine andere antibiotische Salbe, z. B. Gentamycin oder Terramycin topisch, um Infektionen zu verhindern, und 0,5% Proparacainhydrochlorid zur Analgesie. Lassen Sie die Tiere sich auf einer Heizmatte erholen, bis sie sich wieder bewegen, setzen Sie sie dann in eine warme Box und versorgen Sie sie mit zusätzlicher Nahrung, wie z. B. einem Nahrungsergänzungsmittel oder einer angefeuchteten normalen Nahrung, bis die Genesung abgeschlossen ist. Bei Tieren, die Anzeichen von Schmerzen zeigen, sollte 24 Stunden nach der Operation eine systemische oder lokale Analgesie verabreicht werden. Halten diese Symptome trotz Behandlung an, sollten die Tiere auf humane Weise gekeult werden.
14. Verwenden Sie das kontralaterale Auge als nicht bedienbare Steuerung.
15. Nehmen Sie alle 2-3 Tage nach der Verabreichung von Kügelchen und danach alle 2-3 Tage IOD-Messungen mit einem Rebound-Tonometer vor, das für die Verwendung im Rattenauge kalibriert ist.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
250-300 g weibliche Braune Norwegen-Ratten	Harlan Großbritannien	203
Tonolab Rebound Tonometer	Tiolat	TV02
Ketaset (Ketamin)	Fort Dodge Tiergesundheit	BN1000118	37,5 mg/kg
Domitor (Medetomidinhydrochlorid)	Orion Pharma	140-999	0,25 mg/kg
Povidon-Jod	Ecolab	BN4369LE10	5 % in H2O
Minim's Kochsalzlösung	Bausch und Lomb	PL00033/5017
Ringkernmagnet	Supermagnete	R-10-07-03-N
Magnetische Mikrosphären	Bangs Laboratorien	UMC4N/9692
HBSS	Invitrogen	14025
Nadel mit 33 Gauge	Hamilton	7747-01	Benutzerdefinierte Nadel
Luer-Spitzenspritze	Hamilton	80601
Antisedan (Atipemezolhydrochlorid )	Orion Pharma	141-003	0,25 mg/kg
Chloramphenicol-Salbe	Medicom	18956-0005