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Alle Verfahren, bei denen Tierproben verwendet werden, wurden von der zuständigen Kommission für die ethische Überprüfung der Tiere überprüft und genehmigt.
1. Vorbereitung von Objektträgern und Gewebe
- Verwenden Sie entweder Objektträger zur Silanvorbereitung oder Membranglasobjektträger aus Polyethylennapthalat (PEN).
- Für die RNA-Isolierung tauchen Sie Objektträger in RNase-Dekontaminationslösung, waschen Sie sie 3 Mal mit RNase-freiem Wasser, dehydrieren Sie sie dann mit einer abgestuften Reihe von RNase-freiem Ethanol und trocknen Sie sie 30 Minuten lang im Vakuum.
- Schneiden Sie Gewebeschnitte mit einem Kryostaten bei einer Dicke von 10 μm und montieren Sie sie auf die vorbereiteten RNase-freien Objektträger. Halten Sie die Schnitte während des Schnitts eingefroren, um die RNA-Qualität zu erhalten. HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass das Gewebe ca. 4 mm von den Rändern des Objektträgers entfernt ist, da das LCM kein Gewebe entfernen kann, das zu nahe an den Rändern des Objektträgers liegt. Um Gewebe von einem PEN-Objektträger zu entfernen, stellen Sie sicher, dass das Gewebe 4 mm von der linken, oberen und unteren und 7 mm von der rechten Seite des Objektträgers entfernt ist, was den Abmessungen der Membran entspricht, die nicht am Objektträger befestigt ist.
- Für die Isolierung einzelner Zellpopulationen mittels direkter Immunhistochemie wird das Gewebe entweder auf die Silanpräparate oder die PEN-Membranpräparate geschnitten. Für die Isolierung von Geweberegionen mit indirekten immunhistochemisch gesteuerten Techniken montieren Sie einen Satz Schnitte auf einem Silanpräparat für die Immunhistochemie und alternative Schnitte entweder auf einem PEN-Membranobjektträger und/oder einem Silanpräparat, um für LCM verwendet zu werden.
2. Gewebevorbereitung für die Laseraufnahme – Schnelle Tyrosinhydroxylase-Immunhistochemie für die direkte Lasererfassung immunreaktiver Zellen
- Gewebe mit einem hydrophoben Stift umreißen und trocknen lassen.
- Fixieren Sie das Gewebe in einer Aceton-Methanol-Lösung (1:1) bei -20 °C für 10 min. HINWEIS: Unsere Erfahrung hat gezeigt, dass die Aceton-Methanol-Fixierung zu einer viel konsistenteren Immunhistochemie führte als Aceton oder Methanol allein.
- Spülen Sie den Objektträger in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) mit 1% Triton (RNase-frei).
- Decken Sie die Abschnitte mit 100-200 μl PBS mit 1% Triton ab, mit Tyrosinhydroxylase-Antikörper, verdünnt 1:100 mit 400 U/ml RNasin. 5-10 Min. inkubieren.
- Zweimal kurz in PBS und PBS-1% Triton spülen.
- Decken Sie das Gewebe mit 100-200 μl Anti-Kaninchen-IgG ab, markiert mit Alexa Fluor 488, verdünnt 1:100 in PBS-1% Triton mit 400 U/ml RNasin und 50 ng/ml DAPI. 5 Min. inkubieren.
- 2 Mal in PBS spülen und dann 30 s in einer abgestuften Serie von RNase-freiem Ethanol dehydrieren (75%-75%-95%-95%-100%-100%).
- Inkubieren Sie in zwei Wäschen Xylol für 1 min, dann 5 min.
- Entfernen Sie die Objektträger unmittelbar vor der Verwendung für LCM aus dem Xylol und lassen Sie sie an der Luft trocknen.