Untersuchung des Transports von Membranproteinen in Drosophila-Photorezeptorzellen

Zusammenfassung

Quelle: Wagner, K. et al., Untersuchung des Membranproteintransports in Drosophila-Photorezeptorzellen unter Verwendung von eGFP-markierten Proteinen. J. Vis. exp. (2022).

Dieses Video zeigt die Visualisierung des Membranproteintransports in Drosophila-Photorezeptorzellen unter Verwendung von eGFP-markierten TRPL-Proteinen. Es beschreibt die Vorbereitung transgener Fliegen für die Bildgebung, die Aufnahme von Fluoreszenzbildern von Photorezeptorzellen und die Quantifizierung des TRPL-Transports durch Messung der relativen eGFP-Fluoreszenz in den Rhabdomen.

Protokoll

1. Allgemeine Überlegungen

1. Verwenden Sie Drosophila-Stämme, die ein dauerhaft rhabdomral lokalisiertes translozierendes Protein exprimieren, für Analysen bezüglich des Proteintransports (z.B. transient receptor potential-like (TRPL) Ionenkanal:: verstärktes grün fluoreszierendes Protein (eGFP), Arrestin 2 ( Arr2)::eGFP).
2. Bestimmen Sie die Lichtbedingungen ausgewählter Fliegen für den experimentellen Ansatz vor.
   1. Für eine dunkle Anpassung bewahren Sie die Fliegen für den gewünschten Zeitraum bei 25 °C in dunklen Boxen auf. Für eine Beleuchtung von bis zu 16 Stunden in Translokationsexperimenten (z.B. TRPL::eGFP exprimierende Fliegen) halten Sie die Fliegen unter einer Leuchtstoffröhre bei Raumtemperatur.
   2. Um Fliegen mit farbigem Licht zu beleuchten, verwende verschiedenfarbige transparente Plastikboxen zusammen mit der Leuchtstoffröhre.

2. Wasserimmersionsmikroskopie

1. Fliegenvorbereitung<ol style='list-style-type:decimal;'>
2. Bereiten Sie den Arbeitsbereich mit den erforderlichen Geräten und Reagenzien vor, wie in Abbildung 1 gezeigt. Fliegen mit vorgegebenem Alter und vorgegebenen Lichtverhältnissen in ein vorgekühltes 15-ml-Zentrifugenröhrchen geben und betäuben, indem sie 15 bis 30 Minuten lang auf Eis inkubiert werden.
   HINWEIS: Nehmen Sie 1 Tag alte, dunkel angepasste Fliegen als Referenz mit. Generell sollten dunkel angepasste Fliegen im Dunkeln in eine Eisbox mit Deckel umgesiedelt werden. Lichtangepasste Fliegen können bei Raumlicht auf das Eis übertragen werden.
3. Übertragen Sie eine eisbetäubte Fliege kopfüber in eine 200 μL Pipettenspitze und schieben Sie die Fliege vorsichtig mit Druckluft in Richtung Spitze.
4. Schneiden Sie die Pipettenspitze direkt vor dem Kopf mit einem Skalpell ab. Schieben Sie den Hosenschlitz mit einer Pinzette vorsichtig einige Millimeter von der Spitze weg. Schneiden Sie die Pipettenspitze wieder ab und schieben Sie die Fliege mit Druckluft zurück in Richtung Spitze, so dass nur noch der Kopf der Fliege aus der Pipettenspitze herausragt.
5. Klebe ein Stück Plastilin auf einen Objektträger und drücke die Pipettenspitze hinein, so dass entweder das linke oder das rechte Auge der Fliege nach oben zeigt (Abbildung 2A). Verwenden Sie unmittelbar vor der Bildaufnahme eine Laborpipette, um einen großen Tropfen gekühlten Wassers auf die Unterseite eines Wasserimmersionsobjektivs zu kleben (Abbildung 2B). Fahren Sie sofort mit der Bildaufnahme fort, um die besten Ergebnisse zu erzielen.
   HINWEIS: Eine signifikante Verzögerung bei der Bildaufnahme führt zu einem Wiedererwachen und Bewegungen der Fliege, was zu verschwommenen Bildern führen kann.
   

Image acquisition

1. Platzieren Sie den Objektträger vorsichtig mit der vorbereiteten Fliege auf dem Mikroskoptisch und wählen Sie ein Wasserimmersionsobjektiv aus.
2. Senken Sie das Wasserimmersionsobjektiv manuell ab, bis das Auge der Fliege den Tropfen berührt (Abbildung 3A, B).
3. Schalten Sie die Mikroskop-UV-Lampe ein und wählen Sie das passende Filterset aus. Positionieren Sie die Fliege mit den Okularen unter dem Objektiv und fokussieren Sie das Mikroskop auf die Oberfläche des Auges.
4. Schalten Sie den Lichtweg zur Mikroskopkamera um und erzeugen Sie ein Live-Bild in der entsprechenden Software. Stellen Sie den Fokus für die Kamera neu ein und bewerten Sie die Ausrichtung des Auges, wobei zu berücksichtigen ist, dass das Auge radial auf das Mikroskopobjektiv gerichtet sein muss, wie in Abbildung 3C-E ausführlicher dargestellt.
5. Verwenden Sie die entsprechende LUT (Nachschlagetabelle) in der Imaging-Software, um Übersättigung zu erkennen (angezeigt als rote Pixel).
6. Im Falle von nicht pigmentierten Fliegen passen Sie die Belichtungszeit so an, dass die hellsten Pixel für jedes Bild knapp unter der Sättigungsgrenze liegen.
7. Nehmen Sie ein Bild auf und speichern Sie es als Rohdatei, um alle entsprechenden Metadaten der Aufnahme zu archivieren. Exportieren Sie das Bild in einem .tif Format für die folgende Quantifizierung.
   HINWEIS: Beleuchten Sie die Fliegen sofort nach der Bildaufnahme 5 Minuten lang mit rotem Licht (z.B. 630 nm), wenn sie für weitere Experimente verwendet werden sollen. Rotes Licht deaktiviert die Phototransduktionskaskade, die während der Bildaufnahme durch intensives kurzwelliges Licht übermäßig aktiviert wurde.
   

Datenanalyse und Quantifizierung der relativen eGFP-Fluoreszenz in den Rhabdomen von Wasserimmersionsmikroskopen

1. Laden Sie die Software ImageJ/Fiji herunter, installieren Sie sie und führen Sie sie aus.
2. Passen Sie die ImageJ-Einstellungen an, indem Sie auf >Analysieren > Messungen einstellen klicken... und aktivieren Sie nur das Kontrollkästchen für Mittlerer Grauwert. Importieren Sie ein .tif Bild, indem Sie auf Datei > Öffnen... oder per Drag & Drop. Wählen Sie einen repräsentativen Bereich des Bildes aus, der scharf ist, und vergrößern Sie ihn auf 200 % bis 300 %, indem Sie wiederholt Strg und + gleichzeitig drücken.
3. Wählen Sie das Oval-Werkzeug aus und erzeugen Sie bei gedrückter Umschalttaste eine kreisförmige Auswahl im Bild, die deutlich kleiner ist als ein fluoreszierender Rhabdomer. Bevor Sie die Maustaste loslassen, suchen Sie nach der genauen Größe, die unter der Symbolleiste im ImageJ-Hauptfenster angezeigt wird. Verwenden Sie für alle Analysen die gleiche Größe der kreisförmigen Auswahl.
   HINWEIS: Die genaue Größe der kreisförmigen Auswahl in Pixeln oder Mikrometern hängt von der jeweiligen Einrichtung ab. Verwenden Sie einen Kreis mit etwa 1/3 oder 1/4 des Rhabdomendurchmessers von 1 Tag alten, dunkel angepassten Kontrollfliegen.
4. Verschieben Sie die kreisförmige Auswahl entweder durch Mausklick und Ziehen oder durch Drücken der Pfeiltasten auf der Tastatur.
5. Um die Fluoreszenzintensitäten innerhalb der kreisförmigen Auswahl zu messen, verschieben Sie den Kreis auf den ersten Rhabdomer (r1) und klicken Sie auf >Analysieren > Messen oder verwenden Sie die Tastenkombination Strg + M. Es öffnet sich ein Ergebnisfenster, in dem der gemessene Grauwert aufgelistet ist.
6. Fahren Sie fort mit Messungen von r2-r6 als wiederholte Messungen und einer Messung des Hintergrundsignals (b). Bei nicht pigmentierten Fliegen sind zusätzliche Messungen der entsprechenden Zellkörperareale (c1-c6) vorzunehmen (Abbildung 4).
7. Wiederholen Sie die Schritte 2.3.5 und 2.3.6 für zwei weitere Ommatidien, was zu drei technischen Replikationen führt. Markieren Sie die analysierten Ommatidien mit dem Bleistiftwerkzeug und speichern Sie dieses Bild zur Dokumentation.
8. Wählen Sie die gemessenen Grauwerte aus dem Ergebnisfenster aus, kopieren Sie sie und fügen Sie sie in eine Tabellenkalkulationssoftware ein, um weitere Berechnungen durchzuführen. Sortieren Sie die Werte der Fluoreszenzintensität nach ihrer Herkunft in die Kategorien Rhabdomer (r), Zellkörper (c) und Hintergrund (b). Berechnen Sie die mittlere Intensität aus jeder Kategorie (Ir, Ic, Ib).
9. Berechne die relative Menge an eGFP, die im Rhabdomer vorhanden ist.
10. Fahren Sie mit dem nächsten Bild in Schritt 2.3.3 fort. Es wird empfohlen, Bilder von mindestens fünf Individuen jeder Versuchsgruppe als biologische Replikate zu verwenden, um eine zuverlässige Messung zu erhalten.

Ergebnisse

Abbildung 1: Arbeitsbereich der Wasserimmersionsmikroskopie. Benötigte Materialien sind: (A) 15 mL Zentrifugenröhrchen, (B) Eisflocken, (C) gekühltes destilliertes Wasser, (D)...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
15 mL Zentrifugenröhrchen	Greiner Bio-One	188271
Kohlendioxid-Anästhesie-Fliegenkissen	Flystuff	59-172<
Kaltlichtlampe (KL 1500 LCD)	Zeiss
Fiji/ImageJ	NIH
Fluoreszenzmikroskop mit UV-Lampe, Kamera, Filterset und Software (AxioImager.Z1m, Axiocam 530 mono, 38 HE, ZEN2 blue edition)	Zeiss
Leuchtstoffröhre	Osram	4050300518039.00<
Laborpipette (20-200 μL)	Eppendorf
Object slide	Roth	656.1
Pipettenspitzen (200 μL)	Labsolute	7695844
Plasticine (Blu-Tack)	Bostik	30811745
Stereomikroskop (SMZ445)	Nikon
Stereomikroskop mit UV-Lampe, Kamera, Filer-Set und Software (MZ16F, MC170 HD, GFP3, LAS 4.12)	Leica

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