Nachweis von Histonmodifikationen in Hefezellen mit neurodegenerativer Proteinüberexpression

Zusammenfassung

Quelle: Bennett, S. A., et al., Charakterisierung posttranslationaler Modifikationsveränderungen in neurodegenerativen Proteinopathiemodellen für Hefe. J. Vis. Exp. (2019).

Dieses Video zeigt das Verfahren zur Beurteilung von Histonmodifikationen in Hefezellen, die neurodegenerative Proteine überexprimieren. Die Schritte umfassen Zelllyse, Zentrifugation, Elektrophorese, Membrantransfer und antikörperbasierten Nachweis modifizierter Histone.

Protokoll

1. Zelllyse und Western Blotting zum Nachweis posttranslationaler Histonmodifikationen

1. Cell lysis
   1. Hefezellpellets auf Eis auftauen und Zellpellets in 100 μl dH₂O resuspendieren.
   2. Zur Zellresuspension fügen Sie 300 μl 0,2 M NaOH und 20 μl 2-Mercaptoethanol hinzu. Resuspendieren Sie durch Auf- und Abpipettieren.
   3. Inkubieren Sie Zellen 10 Minuten lang auf Eis und zentrifugieren Sie sie dann bei 3.200 x g auf einer Tischzentrifuge für 30 s bei RT. Überstand verwerfen.
   4. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 100 μL 1x Ladefarbstoff und kochen Sie es 10 Minuten lang auf einem Heizblock.
      HINWEIS: Das Rezept für das 6-fache Laden von Farbstoff finden Sie in der Materialtabelle.
2. Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese und Membrantransfer
   1. Bereiten Sie die Gelkammer vor, indem Sie zwei Gele in einen Gelhalter geben, die innere Kammer nach oben mit Laufpuffer füllen und die äußere Kammer bis zur Zwei-Gel-Linienmarkierung füllen.
   2. Laden Sie 15 μl Probe pro Vertiefung in ein 10-Well-Gel mit 12 % Polyacrylamid. Für die Proteinleiterbahn laden Sie 5 μl.
   3. Lassen Sie das Gel etwa 45 Minuten lang bei 150 V laufen, oder bis die Vorderseite des Ladefarbstoffs den Boden des Gels erreicht.
   4. Während das Gel läuft, bereite dich auf den Membrantransfer vor, indem du Faserpads (zwei pro Gel) in Transferpuffer (Tabelle der Materialien) einweichst und die Polyvinylidenfluorid (PVDF)-Membran in Methanol einweichst. Spülen Sie die Membran vor dem Transfer im Transferpuffer ab.
      HINWEIS: Die PVDF-Membran sollte auf die Größe des Gels zugeschnitten werden und für jedes übertragene Gel eine PVDF-Membran verwenden.
   5. Montieren Sie auf einer halbtrockenen Transferapparatzelle ein Transfer-'Sandwich': Platzieren Sie von der unteren Elektrode (1) ein vorgetränktes Faserpad, (2) eine vorgetränkte und gespülte PVDF-Membran, (3) Gel und (4) ein zweites vorgetränktes Faserpad.
      HINWEIS: Um Luftblasen im Transfer-'Sandwich' zu vermeiden, rollen Sie das 'Sandwich' vorsichtig mit einer serologischen Pipette, um Blasen herauszudrücken. Sobald das Gel auf die PDVF-Membran gelegt wurde, bewegen Sie es nicht.
   6. Um den Proteintransfer durchzuführen, stellen Sie das Netzteil für 1 h auf 150 mA ein (für ein 'Sandwich').
3. Nachweis von posttranslationalen Histonmodifikationen (PTMs) mit modifikationsspezifischen Antikörpern
   1. Entfernen Sie die Membran aus dem Transferapparat. Kurz mit dH₂O nachspülen.
      1. Optional können Sie die Übertragung von Proteinen mit Ponceau-S-Färbung überprüfen, indem Sie genügend Ponceau-S-Färbung einfüllen, um die Membran in einer kleinen Plastikbox zu bedecken, und bei RT unter leichtem Schütteln 30-60 s inkubieren. Entfernen Sie den Ponceau-S-Fleck und spülen Sie ihn mit dH₂O aus, bis der Hintergrundfleck verschwindet und die Proteinbanden mit bloßem Auge sichtbar sind. Fahren Sie mit dH₂O fort, bis alle Flecken von der Membran entfernt sind.
   2. Blockieren Sie die Membran, indem Sie den Blot 1 h lang bei RT inkubieren und dabei sanft in Tris-gepufferter Kochsalzlösung (TBS) blockierendem Puffer (Tabelle der Materialien) in einer kleinen Färbebox wiegen. Verwenden Sie genügend Blockierungspuffer, um den Blot abzudecken.
      HINWEIS: Achten Sie darauf, die Membran aufrecht in die Färbebox zu legen, so dass die Membranseite, auf der die Proteine liegen, nicht nach unten zeigt.
   3. Inkubieren Sie den Blot über Nacht in der Färbebox mit einem Histonmodifikations-spezifischen Antikörper, der bei 4 °C gegen Hefe reaktiv ist. Verdünnen Sie den Antikörper in TBS-Blockierungspuffer gemäß den Herstellerangaben. Umfassen Sie auch eine geeignete Kontrolle der Kernbelastung, wie z. B. Anti-Gesamt-H3, das in einer anderen Wirtsspezies als dem modifikationsspezifischen Antikörper gezüchtet wurde. Wenn Sie beispielsweise mit einem Anti-H3S10ph-Antikörper, der in Kaninchen gezüchtet wurde, auf H3S10ph untersuchen, verwenden Sie einen in Mäusen gezüchteten Anti-Gesamt-H3-Antikörper als Belastungskontrolle. Wiederholen Sie dies bei Bedarf für jeden Klecks.
      HINWEIS: Antikörperverdünnungen können innerhalb eines Monats insgesamt dreimal wiederverwendet werden. Bei 4 °C lagern.
   4. Waschen Sie die Membran 4x in hausgemachtem TBS + 0,1% Polysorbat 20 (TBST) für 5 min mit Schaukeln bei RT.
   5. Inkubieren Sie den Blot mit fluoreszierenden Sekundärantikörpern in herstellerspezifischen Verdünnungen (Esel Anti-Kaninchen 680 und Esel Anti-Maus) für 1 h bei RT.
      HINWEIS: Fluoreszierende Sekundärantikörper müssen sowohl während der Lagerung als auch während der Verwendung vor Licht geschützt werden. Führen Sie die Inkubation in dunklen Plastikboxen durch oder decken Sie sie mit Alufolie ab.
   6. Wasche die Membran 4x mit TBST für 5 min und wasche sie mit TBS für 5 min, während du bei RT rockst.
   7. Visualisieren Sie den Blot auf einem fluoreszierenden Western-Blot-Bildgebungssystem für 2 Minuten. Visualisieren Sie die Anti-Kaninchen-680- und Anti-Maus-800-Sekundärantikörper in den 800-nm- bzw. 700-nm-Kanälen.
      HINWEIS: Replikationen werden unabhängig voneinander ab Abschnitt 1 durchgeführt. Für eine angemessene Dateninterpretation in diesen Experimenten ist es notwendig zu überprüfen, ob die Antikörper-Signalantwort innerhalb des Bereichs liegt, über den die Signalantwort linear ist.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
10x Running Buffer			Mix: 141,65 g Glycin (ThermoFisher BP381-1), 30,3 g Tizma-Base (Sigma-Aldrich T6066), 10 g Natriumdodecylsulfat (Sigma-Aldrich L3771) und 1 l deionisiertes Wasser, pH 8,8.
12% Polyacrylamid-Gele	BIO-RAD	456-1041<
2-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M3148<
Anti-Acetyl-Histon H3 (Lys14) Primär Antibody	MilliporeSigma	07-353 (Lot Nr. 2762291)	Verdünnung: 1/1000<
Abcam	ab109463 (Lot-Nr. GR187780)	Verdünnung: 1/2000<
Abcam	ab46983 (Los-Nr. GR71882)	Verdünnung: 1/5000<
Abcam	ab9049 (Los-Nr. GR266894, GR3236147)	Verdünnung: 1/1000<
ab24834 (Los-Nr. GR236539, GR174196, GR3194335)<
ab188292 (Los-Nr. GR211874)	Verdünnung: 1/1000<
Abcam	ab5176 (Los-Nr. GR264582, GR192662, GR3217296)<
Eppendorf	6133000010
Centrifuge 5804/5804 R/5810/5810 R	Eppendorf	22625501
Donkey Anti-Mouse IRDye 800 CW	LI-COR	926-32212 (Los-Nr. C60301-05, C61116-02, C80108-05)	Verdünnung: 1/5000<
LI-COR	926-68073 (Lot-Nr. C60217-06, C70323-06, C70601-05, C80116-07)	Verdünnung: 1/2500<
Sigma-Aldrich	E7023
Extra dickes Fleckenpapier (Filterpapier)	BIO-RAD	1703968
Immobilon-FL Transfermembranen	MilliporeSigma	IPFL00010
Loading Dye			Mix: 1,2 g Natriumdodecylsulfat, 6 mg Bromphenolblau (Sigma-Aldrich B8026), 4,7 mL Glycerin, 1,2 mL 0,5M Trizma Base pH 6,8, 0,93 g DL-Dithiothreitol ( Sigma-Aldrich D0632) und 2,1 mL deionisiertes Wasser.
Methanol	ThermoFisher	A412-4
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoeresis Cell	BIO-RAD	1658004<
Mehrkanalpipette	Eppendorf<
Nuclease Free	Qiagen	129114
Odyssey Fc Imaging System	LI-COR Biosciences	2800-03<
pAG303GAL-a-synuclein-GFP	Geschenk von A. Gitler
pAG303GAL-ccdB	Addgene	14133<
pAG303Gal-FUS<	29614<
pAG303GAL-TDP-43	Geschenk von A. Gitler
Poly(ethylenglykol) (PEG)	Sigma-Aldrich	P4338<
Ponceau S stain	Sigma-Aldrich	P3504<
PowerPac Basic Power Supply	BIO-RAD	164-5050<
Natriumdodecylsulfat Ladepuffer			Bei -20 °C lagern. 6X, Mix: 1,2 g Natriumdodecylsulfat, 6 mg Bromphenolblau, 0,93 g DL-Dithiothreitol, 2,1 mL deionisiertes Wasser, 4,7 mL Glycerin und 1,2 mL 0,5 M Trizma-Base, pH 6,8.
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	221465	Bereiten Sie 0.2 M Lösung vor.
TBS + 0.1% Tween 20 (TBST)			Mix: 100 mL 10X TBS, 1 mL Tween 20 (Sigma-Aldrich P7949) und 900 mL deionisiertes Wasser.
TBS Blocking Buffer	LI-COR	927-5000<
Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell	BIO-RAD	170-3940
Transfer Buffer			Mix: 22,5 g Glycin, 4,84 g Tizma Base, 400 mL Methanol, 1 g Natriumdodecylsulfat und 1,6 l deionisiertes Wasser.
Tris-gepufferte Kochsalzlösung (TBS)			10X, 7.6 pH, Lösung: Mischen Sie 24 g Trizma-Base und 88 g Natriumchlorid (Sigma-Aldrich S7653). Füllen Sie bis zu 1 L mit entionisiertem Wasser.
WT 303 S. cerevisiae yeast	Geschenk von J. Shorter

td style='width:314pt;'> td style='width:314pt;'> td style='height:46.5pt;width:135pt;'>Anti-Acetyl-Histon H4 (Lys16) Primärer Antikörpertd style='height:46.5pt;width:135pt;'>Anti-Acetyl-Histon H4 (Lys12) Primärer Antikörpertd style='height:46.5pt;width:135pt;'>Anti-Dimethyl-Histon H3 (Lys36) Primärer Antikörpertd style='height:62.0pt;width:135pt;'>Anti-Histon H3 Primärer Antikörper<td style='width:108pt;'>Abcamtd style='width:314pt;'>Kontrolle der nuklearen Beladung; Verdünnung: 1/2000<td style='height:46.5pt;width:135pt;'>Anti-Phospho-Histon H2B (Thr129) Primärer Antikörper<td style='width:108pt;'>Abcamtd style='height:62.0pt;width:135pt;'>Anti-Phospho-Histon H3 (Ser10) Primärer Antikörpertd style='width:314pt;'>Verdünnung: 1/1000<td style='height:15.5pt;width:135pt;'>BioPhotometer D30td style='height:77.5pt;width:135pt;'>Donkey Anti-Rabbit IRDye 860 RDtd style='Höhe:15.5pt;width:135pt;'>Ethanoltd style='width:314pt;'> td style='width:108pt;'>2231300045 Watertd style='Breite:314pt;'> td style='width:314pt;'> td style='width:108pt;'>Addgenetd style='width:314pt;'> td style='width:314pt;'>Bereiten Sie eine 50%ige w/v-Lösung vor.td style='width:314pt;'>Mix: 0,5 g 0,1 % w/w Ponceau S Farbstoff, 5 mL 1 % v/v Essigsäure (Sigma-Aldrich 320099) und 500 mL deionisiertes Wasser.td style='width:314pt;'> td style='width:314pt;'>